Genetica General

GENÉTICA GENERAL

GENETICA GENERAL

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GENÉTICA– RESUMEN (bolillas 2012)

v  1º TEORICO:  PRINCIPIOS GENERALES

Genética: definición objetivos

En un comienzo se definió a la genética como el estudio de la herencia. Pero los fenómenos hereditarios llamaron la atención al hombre mucho antes que existieran la biología o la genética como disciplinas científicas. Esto se observa en la selección artificial, en las enfermedades familiares o hereditarias, en la semejanza de padre e hijo. La palabra genética deriva de GEN y fue en 1860 que Gregor Mendel descubrió la existencia de estas unidades. Entonces podemos decir que la Genética es el estudio de los genes y sus efectos sobre los organismos.

Metodología del análisis genético: Enfoques clásico y molecular (Genética hacia delante y hacia atrás)

La genética clásica es aquélla que se aproxima a la genética en la cual no se emplean herramientas de biología molecular. Los primeros estudios en el campo de la transmisión de los caracteres, de la herencia genética por tanto, corresponden a este campo: por ejemplo, las Leyes de Mendel o el análisis del ligamiento.

La genética molecular es el campo de la biología que estudia la estructura y la función de los genes a nivel molecular. La genética molecular emplea los métodos de la genética y la biología molecular.

Dos modelos de investigación genética:

àGenética hacia adelante (directa): se parte de la observación de una variación en la morfología o función de un organismo (fenotipo) y a partir de ella se rastreanlos genes causales (genotipo). Esto se puede llevar a cabo por entrecruzamientos de fenotipos y observación de la proporción de descendencia.

FenotipoàGenotipo

àGenética hacia atrás (inversa): se parte de los cambios genéticos (genotipo) y se buscan las modificaciones provocadas en el organismo (fenotipo). Se puede llevar a cabo mediante el silenciamiento o sobreexpresión de un gen, empleando ARN de interferencia, deleciones, sustituciones, generación de organismos transgénicos.

GenotipoàFenotipo

Constancia y variación en los seres vivos

La variación genética se debe a que en una población puede haber distintos tipos de un mismo gen denominados alelos. Estos se ubican en una localización específica dentro del cromosoma denominada locus. Puede haber un solo alelo o varios. De acuerdo al organismo (haploide, diploide, poliploide) habrá casos en que haya un solo alelo u otros en el que convivan alelos distintos al mismo tiempo (o cualquier combinación posible).

Tipos de variación:     à Discontinua: un carácter aparece en una población en dos o más formas distintas y fácilmente separables llamadas fenotipos. Cada uno determinado por distintos alelos de un gen. Se distinguen a su vez dos tipos de variación discontinua. El polimorfismo hace referencia a la aparición de dos o más variantes discontinuas comunes dentro de una población (ej.: frutos con alas y sin alas). Cada una se denomina morfo. La mutación es cuando aparece una variante fenotípica rara o excepcional la cual se denomina mutante. Su contraparte es el estado silvestre (ej.: alas normales frente a vestigiales).

àContinua: un carácter aparece en una población en un espectro ininterrumpido de fenotipos. Los caracteres intermedios presentan una frecuencia mayor que los extremos. La distribución es de una campana de Gauss (ej.: caracteres métricos como la altura, peso, grado de pigmentación).

Genes y Ambiente

Hay dos posiciones. Una de ellas le da preponderancia a la acción de los genes en la determinación morfológica y fisiológica de los organismos (determinación genética). La otra considera como factor decisivo al medio ambiente (determinación del medio ambiente).

Determinación genética: los genes actúan como un conjunto de instrucciones que transforman materias primas desorganizadas aportadas por el medio ambiente en un organismo específico.

Determinación del medio ambiente: el medio ambiente más la sumatoria de sus factores ambientales son los determinantes de las diferencias entre los organismos. Los genes brindan las reglas genéticas generales.

“Tercera postura combinada” Conforme un organismo va pasando, mediante su desarrollo, de un estado a otro, sus genes interaccionan con su medio ambiente en cada momento de su historia vital. Es esta acción conjunta de genes y medio ambiente la que determina cómo son realmente los seres vivos.

Genotipo y Fenotipo

Genotipo: conjunto completo de genes heredados por un individuo. Permanece prácticamente invariable a lo largo de la vida e inmodificable por efectos ambientales.

Fenotipo: conjunto de aspectos morfológicos, fisiológicos, de conductas y relaciones ecológicas. Cambian continuamente a lo largo de la vida de un organismo conforme los genes interaccionan con ambientes sucesivos y diferentes.

Norma de reacción y ruido de desarrollo

àNorma de reacción: es el conjunto de resultados posibles (expresados en el fenotipo) que se obtiene al exponer un genotipo determinado en una gama de ambientes posibles. Debido a su amplitud en la práctica se realiza con un carácter determinado. Ver ejemplo de facetas oculares en Drosophila y altura en Achillea.

àRuido de desarrollo: conjunto de variaciones aleatorias en características fenotípicas a pesar de que el genotipo y el medio ambiente estén fijados de forma precisa. Esto podría explicar la diferencia en la simetría de los ojos de Drosophila en cuanto al número de facetas. La aleatoriedad se manifiesta en sucesos moleculares del interior de la célula y que acontecen en la división celular del cigoto. El ruido en el desarrollo provoca que siempre exista incertidumbre en el fenotipo final de un genotipo determinado (a pesar de mantener todas las variables constantes).

Organismos modelo: Sacharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Arabidopsis taliana. Organismos no modelos.

Un organismo modelo debería reunir las siguientes características:

·         Pequeños y por tanto se les puede observar cómodamente.

·         Propiedades biológicas básicas.

·         Tiempo de generación corto.

·         Fácil desarrollo.

·         Mantención a bajo coste.

·         Mucha descendencia.

·         Buena adaptabilidad a condiciones de laboratorio.

·         Ética.

àVirus: bacteriófagos del tipo fago lambda.

àProcariotas: bacteria intestinal Escherichia coli.

àEucariotas: *Hongos levaduras: Saccharomyces cerevisiae; *Hongos filamentosos: Neurospora; *Organismos multicelulares: --Arabidopsis thaliana (plantae), --Drosophila melanogaster (insecta), --Caenorhabditis elegans (Nematoda), --Mus musculus (vertebrata)

Dentro de los organismos no modelos se encuentras todos aquellos que no cumplen con las características citadas. Por ejemplo un primate no puede ser empleado por cuestiones primero éticas además por sus costes de mantenimiento y gran tamaño. A su vez la elección dependerá del tipo de estudio, si intentamos encontrar la cura de una enfermedad humana no emplearemos una archeobacteria que difiere en las propiedades biológicas básicas.

v  2º TEORICO: CICLO CELULAR

Descripción del ciclo.

àDefinición: secuencia ordenada de procesos en la cual una célula duplica su contenido genético y citoplasmico y luego se divide generando descendencia. En resumen la función principal es asegurar la copia y transmisión del material genético. La duración es muy variable entre distintos organismos y en los tejidos mismos de un organismo complejo.

àFases:

Ø  Fase M: periodo durante el cual se lleva a cabo la división celular conformada por la división del núcleo (cariocinesis), mitosis (células somáticas) o meiosis (células madre de los gametos), y la división del citoplasma (citocinesis). Dura aproximadamente el 10% del ciclo.

Ø  Interfase: periodo durante el cual la célula crece, replica su DNA y se prepara para entrar en división celular. En esta etapa hay muchos puntos de regulación.

·         G1: fase en la cual la célula lleva a cabo sus actividades comunes. Continúa a la fase M. Acumulación del ATP gastado en el ciclo precedente, incremento del tamaño celular (síntesis proteica). Mucha variabilidad en cuanto a su duración. Las células que nunca se dividen se encuentran siempre en este periodo y se lo denomina G0.

·         S: síntesis o replicación de DNA. Comienza solo si se alcanzó el tamaño necesario y se acumuló la cantidad de ATP necesaria. Se generan las cromátides hermanas que luego migrarán a cada descendiente en la fase M.

·         G2: durante la fase precedente se consume gran cantidad de ATP y nutrientes. En esta fase la célula crece nuevamente y acumula lo necesario para entrar en la división celular.

Regulación intra y extra celular del ciclo.

àRegulación del ciclo: en las fases del ciclo existen puntos de control que evalúan el estado celular y toman decisiones en cuanto a la progresión o la demora de los periodos. Hay dos puntos de control claves al finalizar G1 y G2. El primero evalúa si el DNA se encuentra indemne (sin mutaciones) ya que esto es esencial antes de replicarlo. A su vez recibe señales extracelulares que determinan si el medio es favorable. El punto de G2 evalúa la correcta replicación del DNA ya que esto es fundamental antes de entrar en división celular. Al igual que en G1, se evalúan las condiciones externas.

àSeñales intracelulares: el ciclo celular regula todos los procesos llevados a cabo en sus fases con la ayuda de un grupo de proteínas denominadas proteincinasas dependientes de ciclinas (Cdk). Estos reguladores pueden fosforilar/desfosforilar a intermediarios que actúan en los eventos claves de cada fase. A su vez pueden activarse/inactivarse como interruptores. Ligado a esto último se encuentran las ciclinas, proteínas que se acoplan a las proteincinasas cambiando su estado. Sus concentraciones varían de manera cíclica (por acumulación y destrucción), gracias a esto ciertos procesos mediados por Cdk se estimulan o reprimen dependiendo la fase del ciclo.

(en fines de G2)Control del ingreso a fase M: se lleva a cabo por M-Cdk la cual debe ser activada por la ciclina M. La proteincinasa siempre está presente en el ciclo lo cual no implica que este activada. El determinante es la ciclina M la cual varía de manera cíclica en las fases. Su pico o valor máximo se registra en la fase M lo que coincide con la máxima actividad de M-Cdk. Luego hay una caída exponencial de ciclina M debido a su ubiquitinización por parte de un complejo proteico denominado APC.  Es importante destacar que es la propia M-Cdk activada la que promueve el APC. Es decir que se regula por retroalimentación negativa. El incremento brusco puede explicarse de manera análoga por una retroalimentación positiva. Aparte del ensamble de M-Cdk con su ciclina es necesaria una fosforilación (llevado a cabo por una quinasa) y una desfosforilación (llevado a cabo por una fosfatasa). Cuando M-Cdk esta activa puede actuar activando a estas dos enzimas accesorias promoviendo nuevas activaciones de M-Cdk.

Interrupciones en el ciclo: si una de las fases sufre una demora o un desperfecto entonces el sistema de control del ciclo celular debe retrasar el resto de las fases para seguir la cronología normal. En algunos casos esto se lleva a cabo con proteínas inhibidoras de las Cdk. Por ejemplo si el DNA se encuentra mutado en la fase G1 entonces se dispara un mecanismo que evita su ingreso a S, evitando la replicación del DNA dañado.  Se activan proteincinasas que fosforilan p53 que actúa como factor de transcripción promoviendo al gen p21. Comienza la transcripción y traducción dando como resultado la proteína p21 que es el inhibidor de S-Cdk. En caso de no poder repararse el DNA, p53 induce la apoptosis como mecanismo anti-proliferativo de células anomalas (evitando cáncer).

Una célula puede desmantelar su sistema de control y abandonar el ciclo celular. Estado denominado G0.

Organismos modelos para el estudio del ciclo celular.

àLevadura

Marcadores moleculares para el estudio del ciclo celular

àReporter asociado a genes de ciclinas.

àMicroarreglos.

àAnticuerpos monoclonales.

v  3º TEORICO: DIVISIÓN CELULAR

Mitosis y Meiosis.

àMitosis: proceso que ocurre en el núcleo de las células eucarióticas y que precede inmediatamente a la división celular, consistente en el reparto equitativo del material hereditario (ADN). Este tipo de división ocurre en las células somáticas y normalmente concluye con la formación de dos núcleos separados (cariocinesis), seguido de la partición del citoplasma (citocinesis), para formar dos células hijas. El resultado son dos células genéticamente idénticas a la progenitora.

(Aclaración: la mitosis corresponde solo a la cariocinesis, la citocinesis es un proceso paralelo o separado)

Etapas:

   -Cariocinesis:

-Profase temprana: cromosomas se hacen distinguibles, se hacen cortos por contracción o condensación hasta formar espirales o rollos, estructuras de fácil transporte.

-Profase tardía: desaparecen los nucléolos, membrana nuclear comienza a disgregarse, nucleoplasma y citoplasma se mezclan formando un solo fluido, migración de centriolos a los polos.

-Metafase: se hace visible el huso acromático, serie de fibras paralelas (microtúbulos) que apuntan a cada uno de los polos, cromosomas se desplazan hacia el plano ecuatorial, las fibras que provienen de cada polo se anclan a los cinetocoros de los cromosomas empujando a estos hacia dicho plano.

-Anafase: los pares de cromátides hermanas se separan dirigiéndose cada una a un polo, se forman estructuras en forma de “v” apuntando hacia el polo destino debido al acarreo de los microtúbulos acoplados al cinetocoro.

-Telofase: se forma una nueva membrana nuclear en torno a cada núcleo hijo, los cromosomas se desenrollan, reaparecen los nucléolos. Se despolimeriza el huso acromático.

   -Citocinesis: ocurre la división de la membrana plasmática gracias a un anillo contráctil de actina.

àMeiosis: forma de reproducción celular. Este proceso se realiza en las gónadas sexuales para la producción de gametos. Es un proceso de división celular en el cual una célula diploide (2n) experimenta dos divisiones sucesivas, con la capacidad de generar cuatro células haploides (n). En los organismos con reproducción sexual tiene importancia ya que es el mecanismo por el que se producen los óvulos y espermatozoides (gametos). Este proceso se lleva a cabo en dos divisiones nucleares y citoplasmáticas, llamada primera y segunda división meiótica o simplemente meiosis I y meiosis II.

Etapas:

  -Cariocinesis 1:

-Profase I: Leptotene: cromosomas se hacen visibles y aparecen como filamentos largos y delgados, se forman cromómeros (aéreas engrosadas); Cigotene: ocurre el emparejamiento, cada cromosoma tiene un compañero con el cual se une a lo largo de su longitud (sinapsis), formación del complejo sinaptonémico; Paquitene: cromosomas gruesos y en sinapsis, cromomeros alineados, ocurre el fenómeno de intercambio de material genético; Diplotene: la estructura en sinapsis evidencia cuatro cromatides homologas (tetrade), los cromosomas comienzan a repelerse quedando unido por quiasmas, en esta fase puede ocurrir una pausa (dictioteno) ; Diacinesis: similar a diplotene, hay mayor condensación formando unidades compactas de fácil traslado, persisten quiasmas.

-Metafase I: desaparece membrana nuclear y nucléolos, cada par homólogo ocupa posición ecuatorial, no hay replicación ni separación de centrómeros, se forma el huso acromático, las fibras de un polo se unen al cinetocoro de un homólogo y las del otro polo a la del segundo homólogo.

-Anafase I: cada cromosoma homólogo se mueve hacia un polo.

-Telofase: es variable, puede haber o no restitución de membrana nuclear y entrar directo a meiosis II.

-Interfase: no se lleva a cabo la duplicación del material genético.

  -Citocinesis 1: las células se dividen. Cada una presenta un número haploide de cromosomas pero cada uno de ellos esta duplicado así que el contenido genético es el mismo (aunque repetido).

  -Cariocinesis 2: es muy similar a una mitosis.

-Citocinesis 2: las dos células se vuelven a dividir. Cada una presenta un número haploide de cromosomas y el material genético a la mitad (no repetido).

Diferencias y semejanzas. Importancia de cada una.

	MITOSIS	MEIOSIS
Células implicadas	Se producen en células somáticas. Puede ocurrir tanto en células haploides como diploides ya que no hay emparejamiento de homólogos (no existen en haploides).	Se producen en células madre de los gametos. Ocurre únicamente en células diploides y poliploides ya que precisa emparejamiento de homólogos.
Número de divisiones	Una sola división celular.	Dos divisiones celulares
Anafase	Se separan cromátides hermanas.	En la primera se separan cromosomas homólogos. En la segunda se separan cromátides hermanas.
Entrecruzamiento	No se produce.	Se producen entre las cromatides de los cromosomas homólogos.
Duración	Corta	Larga (incluso puede entrar en pausa de muchos años en su profase I)
Resultado	Dos células hijas con idéntica información genética entre sí y con la célula inicial.	Cuatro células hijas con distinto material genético entre sí y con la célula inicial. Reducción del material a la mitad.
Función	Crecimiento y renovación de células y tejidos. Mantenimiento de la vida del individuo. Única forma de reproducción en organismos haploides.	Aumento de la variabilidad genética (materia prima de la selección natural). Forma de generar gametos en la reproducción de organismos diploides y poliploides.

Ciclos Biológicos.

àDiplonte: el adulto es diploide y la meiosis se lleva a cabo en células diploides especializadas, los meiocitos. Estas se encuentran en las gónadas. Los productos de la meiosis son células haploides diferenciadas denominadas gametos. La fusión de éstos reconstituye la dosis diploide formando un cigoto. Mediante mitosis sucesivas esta célula formará nuevamente un adulto. Una sola generación diploide.

àHaplonte: el adulto es haploide y genera gametos por mitosis. La fusión de éstas da lugar a un cigoto diploide que sufre meiosis originando cuatro esporas haploides que comienzan a sufrir mitosis sucesivas para formar nuevamente adultos haploides. Una sola generación haploide.

àHaplodiplonte: hay alternancia de generaciones, una haploide u otra diploide. Puede haber predominancia de una sobre la otra, ser iguales o muy diferentes morfológicamente, ser dependientes o independientes. El esporofito diploide es la generación que produce esporas por meiosis. Estas sufren mitosis formando el gametofito, generación que produce gametos por mitosis. Los gametos se fusionan reconstituyendo la dosis diploide y por mitosis se forma nuevamente el esporofito.

v  4º TEORICO: ANÁLISIS MENDELIANO

Mendelismo simple.

Los primeros intentos de entender los mecanismos de la herencia se basaban en la herencia mezclada. Intentaba explicar las características parentales compartidas en la descendencia a partir de la mezcla de “esencias” contenidas en el óvulo y espermatozoides.

Hacia 1860 Mendel propuso la teoría de herencia particulada. Los caracteres observados en la descendencia están determinados por unidades discretas que se heredan intactas a lo largo de las generaciones.

Experimentos y leyes de Mendel.

Empleó como material de investigación Pisum sativum (guisantede jardín). Supuso ciertas ventajas como la disponibilidad de muchas variedades, posibilidad de autopolinización (ocurre naturalmente por la quilla) o polinización cruzada (previa emasculación y pasaje de polen), ocupaban poco espacio, eran baratos, tiempo de generación corto y producción de mucha descendencia.

Eligió siete caracteres para su estudio.  Semillas lisas/rugosas, semillas amarillas/verdes, pétalos violetas/blancos, vainas maduras hinchadas/hendidas, vainas inmaduras verdes/amarillas, flores axiales/terminales y tallos largo/cortos.

Obtuvo líneas puras para esos caracteres. Esto le permitió contrastar fenotipos.

                Comenzó cruzando plantas con semillas amarillas x plantas con semillas verdes (generación P parental), el resultado fue una F1 100% amarilla, luego autopolinizó las plantas F1 y también cruzo recíprocamente unas F1 con otras, obteniendo siempre el mismo resultado, una F2 de proporciones 3 amarillas : 1 verde; nuevamente autopolinizó las plantas F2, de las verdes obtuvo siempre verdes, de 1/3 de las amarillas obtuvo siempre amarillas y en los 2/3 restantes vio que se repetía el patrón de 3 amarillas : 1 verde. Posteriormente cruzo las plantas F1 amarillas x Parental verde obteniendo siempre proporciones 1 amarillas: 1 verdes; siendo los mismos resultados para el carácter que fuese que probara (semillas, flores, vainas, etc.) Entonces sobre estas proporciones obtenidas [(3:1) y (1:1) ] propuso un modelo que intentaba explicar cómo eran heredados estos caracteres:

                -Los caracteres se heredan en forma de partículas (genes) que pasan de una generación a otra.

                -Existen para un mismo gen dos variantes (alelos) en cada planta: Y ó y.

                - Una planta puede ser Y/Y; Y/y; ó y/y.

                -En una planta Y/y, el alelo Y domina.

Terminología.

En un cruzamiento entre flores violetas y blancas obtenidas de líneas puras se obtiene una F1 toda violeta (blanco desaparece). Luego de autopolinizar esta descendencia se obtiene una F2 con flores violetas y blancas en proporción 3:1 respectivamente. Reaparece el carácter blanco. Mendel piensa que la F1 recibe de sus progenitores la capacidad de producir individuos blancos y violetas pero uno de ellos enmascara al otro. De allí surgen los conceptos de dominante y recesivo.

Si bien Mendel no acuño los términos fue gracias a él que se descubrieron los genes y alelos.

Los individuos dominantes “puros” se los denominó homocigotas dominantes ya que presentan dos alelos dominantes. Los individuos dominantes “impuros” se los denominaron heterocigotas por presentar alelos dominantes y recesivos. Los individuos recesivos “puros” se los denominó homocigotas recesivos, presentan alelos recesivos.

Nomenclatura: la barra señala qué alelos ocupan determinados loci. Para un heterocigota de un gen cualquiera tenemos un dominante D y un recesivo d. Esto se expresa D/d. El punto y coma define cromosomas distintos. Consideremos a los alelos D y d ubicados en el cromosoma 2. Ahora agregamos dos nuevos alelos, B y b, en el cromosoma 3. Entonces el individuo heterocigota se escribe D/d; B/b. En el caso de encontrarse en el mismo cromosoma se emplean los alelos adyacentes y la barra. Si los alelos D y d se encuentran en el mismo cromosoma 3 que los alelos By b entonces la nomenclatura es DB/db o Db/dB. Por último cuando se desconoce la localización se emplea un punto. Entonces D/d. B/b expresa que no se sabe si se encuentran en el mismo o en distintos cromosomas.

Principios de distribución igualitaria y segregación independiente.

à1° Ley de Mendel: el principio de segregación igualitaria establece que los dos miembros de cada par génico (alelos) se separan de manera igualitaria entre los gametos producidos. De esta forma la mitad de los gametos poseen un alelo y la otra mitad el otro.

Un experimento simple para demostrarlo es un cruzamiento entre una línea pura recesiva (semillas verdes) con un descendiente impuro (semillas amarillas). Las verdes segregan a la mitad de sus gametos el alelo recesivo y a la otra mitad también el alelo recesivo (en definitiva todos los gametos son recesivos), las amarillas segregan a la mitad de sus gametos el alelo dominante y a la otra mitad el recesivo. La F₁ muestra mitad semillas amarillas impuras y mitad verdes.

à2° Ley de Mendel: el principio de segregación independiente establece que los miembros (alelos) de genes distintos segregan independientemente durante la formación de los gametos.

La proporción 9:3:3:1 no es más que la combinación de dos proporciones 3:1 y 3:1 que actúan independientemente y mediante cálculos matemáticos podemos establecer la relación de ambas. *Esta ley solo se aplica cuando los genes que definen ambos caracteres se localizan en cromosomas distintos.

Línea pura: Una línea pura es una población que produce descendencia homogénea para el carácter específico de estudio. De esta manera toda descendencia producida por autopolinización o por cruzamiento de individuos de la población serían inevitablemente idénticos para el carácter en estudio.

Cruzamientos monohíbridos y polihíbridos.

Cruzamiento monohíbrido: es aquel que considera solamente un carácter fenotípico. Dicho de otro modo, es aquel que considera un solo gen con sus respectivos alelos.

Cruzamiento polihíbrido: es aquel que considera dos o más caracteres fenotípico. Dicho de otro modo, es aquel que considera dos o más genes, cada uno con sus respectivos alelos.

Cruzamiento de prueba y retro-cruzamiento.

Un cruzamiento de prueba nos permite determinar genotipos desconocidos a partir de su cruza con una línea pura recesiva. Si tenemos un fenotipo dominante este puede ser de dos tipos, homocigota dominante o heterocigota, para determinar cuál es el que se expresa se lo cruza con un homocigota recesivo. Si el resultado es un fenotipo todo dominante entonces el parental incógnita resulta ser homocigota dominante. Si el resultado es mitad dominante y mitad recesivo entonces el parental incógnita resulta ser heterocigota.

Un retrocruzamiento consiste en la cruza de un hibrido con uno de sus progenitores con la finalidad de obtener descendencia con una identidad cada vez mayor a la parental. Se emplea frecuentemente en horticultura y criado de animales (mantención de una elite) y en producción de organismos knock out.

Cuadrado de Punnett y cálculo de proporciones genéticas.

El cuadro de Punnett es un método de obtención de las proporciones fenotípicas y genéticas de una manera sencilla. Consiste en armar un cuadro en el cual se combinen todos los gametos posibles obtenidos del padre y la madre. Su simpleza a su vez trae restricciones, solo sirve para cruzamientos en el cual consideramos pocos caracteres (mono, dihibridos).

Para cruzamientos de parentales en el cual consideramos un grupo mayor de genes conviene emplear el método dicotómico o bien métodos estadísticos (suma y producto de probabilidades).

Análisis de pedigree en el hombre.

Consiste en el análisis de genealogías o escrutinio de los registros familiares. Un miembro de la familia que presenta una enfermedad (propositus) puede emplearse para rastrear la herencia de los genes que la determinaron. Con los datos puede reconstituirse el árbol familiar y el genoma de los individuos.

En el estudio de enfermedades se reconocen cuatro tipos: autosómicas recesivas, autosómicas dominantes, recesivas ligadas al cromosoma X y dominantes ligadas al cromosoma X.

àAutosómica recesiva: está determinada por un alelo anormal recesivo. Claves: padres sanos (portadores) pueden presentar hijos enfermos. Los individuos afectados son indistintamente varones y mujeres (gen de tipo autosómico). Puede haber generaciones enteras que no muestren afectados (pero sigan portando el alelo). Ejemplo: PKU (fenilcetonuria; gen letal); fibrosis quística (gen letal) y albinismo.

àAutosómica dominante: está determinada por un alelo anormal dominante. Claves: se manifiesta en casi todas las generaciones. Los individuos afectados son indistintamente varones y mujeres (gen de tipo autosómico). Ejemplo: pseudoacondroplasia; enfermedad de Huntington; polidactilia; braquidactilia y piebaldismo.

àRecesivas ligadas al cromosoma X: presentan un alelo anormal recesivo localizado en el cromosoma sexual X (presente en hembras en doble dosis y machos en dosis única). Claves: más varones que mujeres lo manifiestan, los descendientes de un hombre afectado serán portadores en caso de ser mujeres y no estarán afectados en caso de ser hombres. Ejemplo: daltonismo; hemofilia; distrofia muscular de Duchenne; síndrome de feminización testicular.

àDominantes ligadas al cromosoma X: presentan un alelo anormal dominante localizado en el cromosoma sexual X. Claves: los varones afectados trasmiten el gen defectuoso a todas las hembras y a ningún macho (reciben el Y), las mujeres heterocigotas casadas con varones sanos trasmiten el gen afectado a la mitad de su descendencia, sea varón o mujer. Ejemplo: hipofosfatemia.

v  5º TEORICO: TEORIA CROMOSOMICA DE LA HERENCIA.

Sus demostraciones E. Carother, Morgan, N. Stevens, Bridges.

àAportes de Boveri: Demuestra la individualidad y permanencia de los cromosomas en toda la vida de la célula (Ascaris)

àAportes de Sutton: Observo un cromosoma que se comportaba diferente en Saltamontes (Brachystola magna) que se identificó como determinante para el sexo, demostrando que un fenotipo (sexo) está asociado a un cromosoma concreto.

                Ambos pudieron inferir que el comportamiento de las partículas de Mendel durante la producción de gametos del guisante se comportaban de una manera similar a la conducta de los cromosomas durante la meiosis: “Los genes están ubicados en los cromosomas” y postulan:

-Genes y cromosomas vienen en parejas.

-Los miembros de una pareja génica se distribuyen igualmente como los miembros de un par de cromosomas homólogos.

- Distintas parejas de genes actúan de forma independiente, así como distintas parejas de cromosomas.

àNettie Stevens estudiando Tenebrio molitor observo que la determinación del sexo viene dada por la presencia o ausencia de un cromosoma heteromorfico llamado “Y” -> Sistema de determinación sexual XY.

àCon estas bases fijadas Morgan en 1909 comenzó sus trabajos con Drosophila (4 pares de cromosomas, crecimiento rápido, pocos requerimientos, machos y hembras fácilmente diferenciables) las crio hasta que encontró una mutación espontanea, un macho con ojos de color blanco, llamo a esta mutación “White” y realizo la cruza de este macho con una hembra de ojos rojos, obteniendo una F1 100% de ojos rojos tal como Mendel predijo, autocruzo esta F1 para obtener una F2 que dio proporciones 3:1 (rojo: blanco) cumpliéndose también con lo predicho por Mendel pero vio también que todas las hembras tenían ojos rojos y los machos tenían ojos rojos y blancos, entendiendo que el color de ojos se relacionaba al sexo. Luego al observar células bajo el microscopio vio que los 4 pares de cromosomas no eran idénticos, sino que las hembras tenían un par de X iguales y los machos tenían un X y un Y que nunca aparece en las hembras, entonces supuso que la descendencia F1 debería recibir un cromosoma X de una hembra y un X o Y del macho, esto explica porque una madre homocigota para ojos rojos daría solo descendencia de machos con ojos rojos aunque el padre tuviera ojos blancos y una madre heterocigota (ojos rojos) con un padre de ojos blancos daría machos mitad de ojos blancos y mitad de ojos rojos. Para que aparezcan individuos con ojos blancos la madre debía portar al menos una copia mutada del gen para color de ojos blancos. Deducción: El gen que codifica para el color de ojos debe residir en el cromosoma X, siendo esta la primera correlación directa de un gen especifico con un cromosoma en particular.

àElinor Carother trabajando con saltamontes demuestra segregación independiente (en cel testiculares) de cromosomas no homólogos, observó un par heteromorfo y uno solitario que migraba a un polo con cualquier cromosoma del par homologo.

àCalvin Bridges redacta su tesis sobre la “no disyunción como prueba de la teoría cromosómica de la herencia” observando y analizando descendiencias excepcionales, pudo concluir que el sexo viene determinado por la relación X/A.

Herencia ligada al sexo. Es un tipo de herencia no mendeliana. Se observan proporciones distintas a las predichas por Mendel. El cruzamiento recíproco brinda resultados diferentes.

Cromosomas sexuales.

àHerencia ligada al Y: corresponde a los genes presentes en la zona diferencial del cromosoma Y. Solamente son heredados a individuos masculinos. El gen SRY (factor determinante de los testículos) se encuentra en el brazo corto del cromosoma Y. Se transcribe solo en el desarrollo embrionario y exclusivamente en células que van a formar los testículos. La presencia de pelos en las orejas es otro carácter presente en un gen en esta zona.

àHerencia ligada al cromosoma X: La herencia ligada al cromosoma X quiere decir que el gen que causa el rasgo o el trastorno se localiza en el cromosoma X .Cabe recordar que las mujeres poseen dos cromosomas X mientras que los hombres poseen un cromosoma X y un cromosoma Y. Los genes del cromosoma X pueden ser recesivos o dominantes, y su expresión en las mujeres y en los hombres no es la misma debido a que los genes del cromosoma Y no van apareados exactamente con los genes del X. Los genes recesivos ligados al cromosoma X se expresan en las mujeres únicamente si existen dos copias del gen (una en cada cromosoma X). Sin embargo, en los varones sólo debe haber una copia de un gen recesivo ligado al cromosoma X para que el rasgo o el trastorno se exprese. Por ejemplo, una mujer puede ser portadora de un gen recesivo en uno de sus cromosomas X sin saberlo y transmitírselo a su hijo, que expresará el rasgo o el trastorno. Entre los ejemplos de trastornos recesivos ligados al cromosoma X se destacan los casos del daltonismo y la hemofilia, enfermedades provocadas por un gen recesivo situado precisamente en el segmento diferencial del cromosoma X. Recalcamos que, debido a su ubicación, para que una mujer padezca la enfermedad debe ser homocigota recesiva (tener el gen recesivo en ambos cromosomas X), mientras que en los hombres basta con que el gen recesivo se encuentre en el único cromosoma X que tienen.

Sistemas de determinación del sexo en eucariotas.

Los cromosomas que conforman un organismo se dividen en autosómicos y sexuales. Estos últimos como su nombre lo indican son los encargados de determinar el sexo. Sin embargo también presentan genes que cumplen funciones similares a la de los genes autosómicos. Cada cromosoma tiene una parte diferencial (genes exclusivos) y una región homologa (genes compartidos y es por donde se aparean en el cross-over de la meiosis).

Hay distintos sistemas que determinan el sexo:

àSistema de determinación XY: en el ser humano hay dos cromosomas sexuales X y Y. La determinación se debe a la presencia o ausencia de Y (XX mujer, XY hombre, X0 mujer). En la mosca de la fruta también se determina por X y Y. Pero el sexo está dado por la cantidad de X (XX hembra, XY macho, X0 macho) en relación con la cantidad de A dando machos,hembras y además supermachos y superhembras. En este sistema decimos que el macho es heterogametico y la hembra homogamética.

àSistema de determinación ZW: en otras especies (mariposas, peces, aves) ocurre lo contrario, el sexo masculino es homogamético (ZZ) y el femenino heterogamético (ZW).

àSistema de determinación XO: otras especies (peces, insectos, anfibios) que no tienen el cromosoma Y determinan el sexo por el número de cromosomas X, macho XO y hembra XX.

Inactivación del cromosoma X: para evitar la doble dosis génica que presentaría una hembra frente a su contraparte masculina ocurre una inactivación azarosa de uno de los dos cromosomas X. Ocurre en un estadio temprano de desarrollo y la condensación da lugar a un cuerpo que se tiñe intensamente y se denomina corpúsculo de Barr. En una hembra que sea heterocigota para un gen ligado al sexo como la inactivación ocurre al azar entonces se presentaran parches donde se exprese un gen y otras regiones donde se exprese el otro. La displasia ectodérmica anhidrótica (carencia de glándulas sudoríparas) es un ejemplo de este tipo. En un hombre se expresa en todo el cuerpo, en una hembra en ciertas regiones.

Herencia citoplasmática.

Además del núcleo, ciertos componentes de las células contienen ADN. Éstos incluyen los cuerpos citoplasmáticos denominados mitocondrias (los productores de energía de la célula), y los cloroplastos de las plantas, en los que tiene lugar la fotosíntesis. Estos cuerpos se autorreproducen. El ADN se replica de manera similar al del núcleo, y algunas veces su código se transcribe y se traduce en proteínas. En 1981 se determinó la secuencia completa de nucleótidos del ADN de una mitocondria. En apariencia, la mitocondria utiliza un código que difiere muy poco del utilizado por el núcleo.

        Los caracteres determinados por el ADN citoplasmático se heredan con más frecuencia a través de la madre que del padre (exclusivamente a través de la madre en el caso del Homo sapiens), ya que los espermatozoides y el polen contienen por lo general menos material citoplasmático que el óvulo.

Naturaleza molecular y citológica de gen y alelos.

Genes ligados y no ligados.

v  6º TEORICO: MENDELISMO COMPLEJO

Función del gen. Un gen es una secuencia ordenada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN, en el caso de algunos virus) que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica, habitualmente proteínas pero también ARNm, ARNr y ARNt.

Esta función puede estar vinculada con el desarrollo o funcionamiento de una función fisiológica. El gen es considerado la unidad de almacenamiento de información genética y unidad de la herencia, pues transmite esa información a la descendencia. Los genes se disponen, pues, a lo largo de ambas cromátidas de los cromosomas y ocupan, en el cromosoma, una posición determinada llamada locus. El conjunto de genes de una especie, y por tanto de los cromosomas que los componen, se denomina genoma. Los genes están localizados en los cromosomas en el núcleo celular.

Experimento de Beadle y Tatum, un gen – una enzima.

à

Relaciones de dominancia.

àHerencia dominante: un gen que codifica para un carácter específico presenta un alelo que domina (o enmascara) sobre otro/s. En heterocigosis si el alelo dominante está presente se expresará cualquiera sea su acompañante. El recesivo solo se expresa en homocigosis. Hay 2 fenotipos.

àDominancia incompleta: un gen que codifica para un carácter específico presenta un alelo que domina (o enmascara) sobre otro/s. Sin embargo, en heterocigosis el fenotipo obtenido es intermedio. Los alelos dominantes o recesivos únicamente se expresan en homocigosis. Hay 3 fenotipos. A nivel molecular puede explicarse por un efecto cuantitativo del número de dosis de transcrito funcional y por ende proteína viable. Por ejemplo: doble dominante produce mucha proteína generando color rojo, heterocigota produce la mitad de proteína generando color rosa y el doble recesivo no produce proteína por ende genera ausencia de color.

àCodominancia: un gen que codifica para un carácter específico presenta un alelo que domina (o enmascara) sobre algunos alelos y comparte función con otros alelos. La heterocigosis puede ser de un alelo dominante frente a su recesivo, en este caso expresa el primero. O puede ser de dos alelos que dominen por igual (codominancia), en este caso ambos expresan.

Interacciones entre genes: complementación, epistasia, supresión, modificadores. Genes letales. Letales sintéticos.

àComplementación: aparición de un fenotipo silvestre en dihibridos cuando se reúnen alelos mutantes recesivos. Mediante la prueba de complementación puedo averiguar si mutaciones que influyen en un determinado carácter se encuentran en el mismo alelo o si están en distintos alelos en el mismo cromosoma o en cromosomas distintos.

àEpistasia: fenómeno que se da en genes que interactúan en la misma ruta. Sucede cuando la acción de un gen se ve modificada por la acción de uno o varios genes. Al alelo del gen que enmascara la expresión de los alelos del otro gen se lo denomina epistático, mientras que al alelo suprimido se le llama hipostático. Este fenómeno puede darse tanto entre genes que segreguen de forma independiente como entre loci que estén ligados.

àTipos: -Recesiva (9:3:4)

-Dominante (12:3:1)

  -Doble recesiva (9:7)

 -Doble dominante (15:1)

  -Doble dominante y recesiva (13:3)

àSupresores: alelo que elimina el efecto de una mutación ocurrida en otro gen dando lugar a un fenotipo silvestre.

àGenes letales: gen cuya expresión produce la muerte del individuo antes de que este llegue a la edad reproductora. Si la expresión de un gen en vez de causar la muerte del individuo causa un acortamiento de su ciclo biológico, un empeoramiento de su calidad de vida o algún daño en su organismo, se denomina gen deletéreo. Al igual que el resto de los genes, los alelos de los genes letales así como los de los deletéreos, sus variables, pueden tener un carácter recesivo o dominante.

Puede observarse pleiotropía en los genes letales, por ejemplo un alelo que en heterocigosis determine un color de pelaje y en homocigosis sea letal. A su vez en su función pleiotrópica el alelo puede ser dominante para el color de pelaje y recesivo para letalidad.

La letalidad puede oscilar entre 0-100%. En casos intermedios se dice que el fenotipo es semiletal o subvital. Ejemplo: en un cruzamiento donde esperamos descendencia 50:50 podríamos observar descendencia 60:40 (propiedad semiletal del recesivo).

Expresividad y Penetrancia. Posibles causas de las mismas.

àPenetrancia: porcentaje de individuos de un genotipo determinado que muestra realmente el fenotipo asociado a ese genotipo.  La penetrancia es del 100% cuando no hay influencia de genes modificadores, epistáticos, supresores o efecto modificador del medio ambiente (causas).

àExpresividad: mide el grado o la intensidad con que se expresa fenotípicamente un genotipo determinado. Las diferencias en el grado de expresión puede deberse a la constitución alélica del resto del genoma o a factores ambientales.

Problemas que traen una incompleta penetrancia y expresividad en el análisis de pedigree.

Una penetrancia variable puede llevarnos a conclusiones erróneas en el diagnóstico médico. Una enfermedad causada por un alelo dominante puede presentar generaciones que no manifiesten la enfermedad y esto se explica por la penetrancia variable. En base a esto no podemos garantizar que ningún miembro de la familia que este sano no tenga realmente el alelo dominante causante de la enfermedad.

La expresividad variable puede traer complicaciones en el diagnóstico. Una enfermedad muy variable puede tener extremos con personas que expresen el fenotipo claramente y otras que casi no lo expresen. Éstos últimos pueden ser diagnosticados como sanos a pesar de ser portadores de la enfermedad.

v  7º TEORICO CITOLOGIA

Complemento cromosómico.

àEs el conjunto de los cromosomas diferentes propio de un individuo o especie, portador de la información genética básica de una especie. Es el conjunto de cromosomas de un gameto, normalmente referido como ‘n’. En el caso del hombre 23, uno de ellos denominado cromosoma sexual (X ó Y). Los organismos diploides poseen dos juegos cromosómicos.

Cariotipo. Idiograma.

àCariotipo: son todas las características numéricas, morfológicas y anatómicas que posee el complemento cromosómico de un grupo organismos taxonómicamente relacionados.

àIdiograma: representación gráfica o esquemática del cariotipo en pares homólogos o del set haploide. Los cromosomas se ordenan según su morfología y en tamaño decreciente.

àCariograma: complemento cromosómico de una sola célula a partir de una fotomicrografía.

Caracteres cromosómicos de importancia en estudios citogenéticos. Número y tamaño cromosómicos. Morfología cromosómica: posición del centrómero y de los organizadores nucleolares.

àNúmero cromosómico:

·         Número básico en organismos diploides.

·         Euplodía aberrante:

o    Poliploidía

o    Monoploidía

·         Aneuploidia

·         Cromosomas supernumerarios: en muchas especies animales y vegetales existen cromosomas supernumerarios o cromosomas B. La distinción entre cromosomas B y los del complemento normal (cromosomas A) fue realizada por primera vez por Randolph en 1928. En general, los cromosomas accesorios presentan las siguientes características:

o    no son indispensables para la vida normal de sus portadores;

o    no son homólogos de ninguno de los cromosomas A, de los que probablemente proceden;

o    por lo general tienen sistemas de herencia irregulares y no mendelianos;

o    morfológicamente, suelen ser más pequeños que los cromosomas del complemento normal, heterocromáticos y alocíclicos;

o    en cuanto a su distribución, los cromosomas B varían en frecuencia:

§  dentro de poblaciones de la misma especie;

§  dentro de individuos de la misma población;

§  dentro de células del mismo organismo;

o    en general carecen de genes mayores, no tienen efectos cualitativos sobre el fenotipo y son dañinos para los individuos que los portan en número elevado.

àTamaño cromosómico: los cromosomas sufren grandes variaciones en su tamaño a lo largo del ciclo celular, pasando de estar muy poco compactados (interfase) a estar muy compactados (metafase), por tal motivo, los estudios sobre el tamaño suelen realizarse en metafase mitótica.

·         Individual: longitud total de cada cromosoma.

·         Complemento: longitud total de todos los cromosomas del complemento.

àMorfología:

·         Presencia de satélites.

·         Posición del centrómero:

o    Metacéntrico

o    Submetacéntrico

o    Subtelocéntrico

o    Telocéntrico

o    Formulas:

§  Diferencia del largo de los brazos(d):      d=l-s    (l=long; s=short)

§  Índice braquial (Ib):   Ib=l/s

§  Índice centromérico(Ic):  Ic=100xs/c   (c=cromosome lenght)

àAspectos moleculares: cantidad de DNA por cromosoma y por complemento.

Distribución de bandas eucromáticas y heterocromáticas.

àLa eucromatina generalmente se observa como bandas de color claro cuando es teñido con colorante Giemsa y se observa a través del microscopio óptico a diferencia de la heterocromatina, que se tiñe en bandas oscuras. La tinción ligera se debe a la estructura menos compacta de la eucromatina.

Técnicas clásicas de tinción y bandeos cromosómicos.

àEn los laboratorios de Citogenética se utilizan varias técnicas de bandeo cromosómico. En este sentido, destaca el método de tinción de las bandas de quinacrina (bandas Q). Fue el primero en emplearse, requiere un microscopio de fluorescencia, aunque su uso ya no está tan extendido como el de las bandas de giemsa (bandas G). Para producir estas bandas G se aplica una tinción de Giemsa tras digerir parcialmente las proteínas cromosómicas con tripsina. Las bandas reversas (bandas R) requieren tratamiento por calor y en ellas se invierte el patrón normal blanco y negro que se observa en las bandas Q y G. Este método destaca por su gran utilidad en la tinción de los extremos distales de los cromosomas. Existen otras técnicas de tinción como las bandas C y las NOR (región de organizadores nucleolares), tiñendo estos últimos específicamente ciertas regiones del cromosoma. Así, las bandas C tiñen la heterocromatina constitutiva, que se localiza normalmente cerca de los centrómeros, y la tinción AgNOR marca los satélites y tallos de los cromosomas acrocéntricos.

FISH. Tipos Sondas.

àFISH o hibridación fluorescente in situ es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así como de las anomalías que puedan presentar. Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética).

­­àCMA/DAPI

àTipos de Sondas:

·         Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean en estudios de microdeleciones.

·         Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores.

·         Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma y así marcar el cromosoma completo. Se usan para ver translocaciones.

Tipo de cromosomas: Cromosomas A, Cromosomas accesorios o B, posibles orígenes, Cromosomas politénicos y plumosos. 

àCromosomas plumosos: Se hallan durante el estadio de la meiosis I denominado diploteno. Luego de este relativamente largo período de la meiosis I, los cromosomas en escobilla vuelven a compactarse durante el período de metafase I. Son estructuras transitorias, específicamente bivalentes (es decir, dos cromosomas apareados cada uno de los cuales está formado por dos cromátidas hermanas). Cada uno de los dos cromosomas está constituido por dos largas hebras que forman muchos "rulos" o "bucles", a la manera de un cepillo o escobilla, a lo largo del eje mayor del cromosoma. Esos "rulos" permiten que el ADN se halle disponible para el proceso de transcripción durante la maduración del ovocito. De hecho, la presencia de cromosomas en escobilla en una célula es indicador de que está ocurriendo la transcripción del ARN mensajero. No están presentes en mamíferos.

Organización de la cromatina, modelo del solenoide y del fractal.

Contenido de DNA, el valor C, relación entre valor C y complejidad evolutiva.

v  ^­­­8º TEORICO:LIGAMIENTO Y RECOMBINACIÓN

Demostración Ligamiento. Experimento Morgan.

àWilliam Bateson y R. C. Punnett fueron los primeros en evidenciar un “acoplamiento” entre alelos al observar proporciones fenotípicas distintas a las esperadas (según el modelo mendeliano). No entendían la naturaleza del acoplamiento.

àHunt Morgan establece a Drosophila como herramienta genética de estudio. Realizando cruzamientos de prueba redescubre el “acoplamiento” de los investigadores. La proporción obtenida se aleja de la mendeliana para un cruzamiento de este tipo (1:1:1:1). Los resultados muestran acoplamiento (dominantes se mantienen juntos) o repulsión (dominantes no se mantienen juntos).

àExplicación desde la teoría cromosómica. Los genes se encuentran sobre el mismo par de cromosomas homólogos. Esto explica las proporciones predominantes que son iguales a las aportadas por los parentales.

àLas proporciones no similares a las parentales son la minoría. La explicación de su aparición desde la teoría cromosómica es el entrecruzamiento acontecido en la meiosis. Los quiasmas son los vestigios de este proceso de intercambio. Las nuevas combinaciones generadas por este proceso se denominan productos de entrecruzamiento.

àConclusión: dos genes situados cerca uno del otro en el mismo par de cromosomas homólogos no cumplen la 2° ley de Mendel de la segregación independiente.

Experimento Creighton-MacClintock. (del pomo)

àEstos investigadores se encontraban estudiando dos genes en el cromosoma 9 del maíz. Un gen codificaba el color (C/c) y el otro codificaba la composición del endospermo (Wx/wx). Uno de los cromosomas homólogos era distinto (par heteromórfico). Presentaba una protuberancia en el extremo q codificaba para el color. A su vez era más largo que su contraparte en el extremo q codificaba la composición del endospermo. Valiéndose de esta clara diferencia pudieron comprobar que en la descendencia recombinante había una traslocación de los genes.

Características del entrecruzamiento: cromátidas que intervienen, doble entrecruzamiento.

àEntrecruzamiento: es el fenómeno que ocurre en profase de Meiosis I en la fase de paquitene. Provoca el intercambio de material genético entre cromátides de cualquiera de los cromosomas (las cromátides no hermanas de los homólogos o también de las cromátides hermanas propias de cada cromosoma). Pueden participar dos, tres o las cuatro cromátides. La cantidad de entrecruzamientos puede ser simple o doble. El establecimiento de un entrecruzamiento condiciona la probabilidad de generar otro nuevo en un sitio adyacente (interferencia).

Concepto de recombinante: Frecuencia de recombinación en Segregación independiente y en Recombinación por entrecruzamiento.

àRecombinación meiótica: cualquier proceso meiótico que da lugar a un producto haploide cuyo genotipo difiere de los dos genotipos haploides que formaron la célula meiótica diploide. El producto generado se denomina recombinante.

àRecombinación mediante segregación independiente: este caso obedece la 2° Ley de Mendel. La proporciones obtenidas en un cruzamiento de prueba son por ende 1:1:1:1 (25% c/u), donde el 50% corresponden a recombinantes y el otro 50% al tipo parental. Según la teoría cromosómica se debe al azar en la segregación de los alelos durante la meiosis.

àRecombinación mediante entrecruzamiento: ocurre en genes ligados a un mismo par homólogo. Si estos se ubican lejos podemos suponer que el entrecruzamiento se efectúa en una alta tasa y los recombinantes son cercanos al 50%. En cambio si los genes se sitúan cada vez más cerca esta frecuencia de recombinación será cada vez menor.

Frecuencias de recombinación útiles para mapear genes.

àAlfred Sturtevant, estudiante de H. Morgan, tuvo la tarea de dilucidar el proceso mediante el cual se generaba tanta variabilidad en la frecuencia de entrecruzamiento (o frecuencia de recombinación). Mientras más lejos se encuentren dos alelos más posibilidad habrá que ocurra un entrecruzamiento y se genere un recombinante (con tendencia al 50%). Con la misma lógica, mientras más cerca se encuentren menos posibilidad habrá de que ocurra un entrecruzamiento (con tendencia al 0%).

àDefinió una unidad de medida (centimorgan [cM], o unidad de mapa [m.u]) para establecer las distancias entre genes. Una unidad de mapa corresponde a la distancia que debe haber entre dos genes para que ocurra una frecuencia de recombinación (RF) del 1%.

àLocus es el lugar que ocupa un gen en el mapa génico.

Prueba de tres puntos.

àSe lleva a cabo con cruzamiento entre un triple heterocigoto y un triple homocigoto recesivo. Se obtienen el número de moscas y el correspondiente a cada fenotipo. Se identifican los fenotipos de las clases parentales, estos no se van a tener en cuenta. Se identifican los fenotipos recombinantes que sí se tienen en cuenta (debemos considerar recombinantes simples y dobles). Se analizan los recombinantes de a pares y se obtienen sus frecuencias de recombinación o unidades de mapa. Se arma el mapeo de los alelos en el cromosoma (en este caso consideramos a los 3 genes ligados, con FR bastante inferior a 50%). Definimos el gen del medio.

Interferencia.

àInterferencia: los cruzamientos que ocurren en un cromosoma dependen unos de otros, a esta interacción que se establece se la denomina interferencia. Un entrecruzamiento reduce la probabilidad de que tenga lugar otro en la región adyacente.

Cartografía cromosómica: construcción de mapas de ligamiento por recombinación, mapas genéticos.

àMapas de ligamiento: sirven para determinar la función (superponiendo con mapa físico), evolución y aislamiento de genes. El efecto de posición hace referencia a los cambios observado en la expresión de un gen en base a la posición que ocupe en el cromosoma. Mediante el estudio de las posiciones relativas de los genes en un cromosoma de dos organismos podemos establecer su nivel de parentesco. El conocimiento de la ubicación de un gen el cromosoma es el primer paso para su aislamiento.

v  9º TEORICO:Continuación LIGAMIENTO Y RECOMBINACIÓN

Mapeo por marcadores moleculares. RFLP y VNTR.

àMarcador molecular: sitio en el que hay heterocigosis para algún tipo de variación neutra en el DNA y que sirve como punto de referencia para determinar la posición de un gen funcional. Los dos tipos fundamentales son las dianas de las enzimas de restricción y el DNA repetido.

àPolimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP): una enzima de restricción bacteriana genera cortes en la cadena de DNA en sitios específicos o dianas. Los fragmentos resultantes pueden evidenciarse con Southern Blot. Una mutación puede generar la desaparición de una diana concreta en uno de los homólogos. Situación de heterocigosis. Esta condición nos permite analizar entrecruzamiento con genes de interés que se encuentren en el mismo cromosoma y analizando la descendencia podemos establecer la distancia que los separa.

àPolimorfismos en VNTR: una clase especial de secuencias sin función conocida denominadas VNTR muestra variación en el número de estas entre diferentes loci y entre distintos individuos de la misma especie. Esta condición genera heterocigosis entre los homólogos. Mediante una sonda y enzimas de restricción que corten por sus extremos los VNTR podemos evidenciarlos mediante Southern. Los genes que se encuentren acompañando éstas secuencias pueden ser cartografiados mediante el análisis de los cruzamientos o recombinaciones.

Ejemplos grupos de ligamiento.

àGrupo de ligamiento: grupo de genes localizados en el mismo cromosoma que tienden a transmitirse como una unidad.

Ejemplos: en el cromosoma X del ser humano se investigaron muchos genes ligados como el albinismo ocular, hemofilia, enzimas del metabolismo de glucosa, ictiosis, proteínas de grupos sanguíneos.

Recombinación mitótica.

àEl termino segregación se emplea para describir la separación de los alelos en dos células diferentes. Esto ocurre en la meiosis. En una mitosis normal nunca hay segregación de alelos. Sin embargo existen anomalías que la producen. La no disyunción mitótica es un fallo en la separación de los cromosomas, las células hijas serán distintas a las parentales, una tendrá tres cromosomas homólogos mientras que la otra uno solo (posibilidad de expresar el recesivo). La pérdida de cromosomas durante la mitosis es otra forma de segregar. Los fenotipos de estos individuos muestran variegación (sectores de tejido somático diferentes) y mosaicos (tejidos con dos o más genotipos distintos).

àRecombinación mitótica: el tercer tipo de segregación que acontece en la mitosis ocurre por un fenómeno de entrecruzamiento. Por alguna razón desconocida y azarosa los cromosomas materno y paterno se aparean e intercambian fragmentos. Al igual que en los casos anteriores el resultado fenotípico es con zonas que expresan el genotipo mutante (gracias al entrecruzamiento) en un fondo silvestre.

Recombinación VDJ.

àLa recombinación V(D)J es un mecanismo de recombinación genética que se da en vertebrados por el cual se selecciona y ensambla al azar segmentos de genes que codifican proteínas específicas con papeles importantes en el sistema inmunitario. Esta recombinación específica de localización genera un repertorio diverso de receptores de linfocitos T (TCR) y moléculas de inmunoglobulina (Ig) que son necesarios para el reconocimiento de diversos antígenos bacterianos, víricos y de parásitos, así como de células disfuncionales, como son las tumorales.

Procariotas y virus descripción genética.

àLos organismos procariotas corresponden a las bacterias y a las algas verdeazuladas (cianobacterias). Los virus no se los considera seres vivos al no reunir ciertas características como la falta de maquinaria metabólica propia. Deben parasitar a una célula para reproducirse. A pesar de ello presentan material genético y propiedades hereditarias similares a todos los organismos. Los que parasitan bacterias se los denomina bacteriófagos. Virus y bacterias son monoploides, no sufren meiosis pero sí recombinación.

àGenética: el material genético de una bacteria está compuesto por un solo cromosoma circular y puede presentar plásmidos que son estructuras circulares (también lineales) libres que se replican con independencia. Un virus se compone de una cadena de DNA o RNA envuelta en una cápside proteica.

Ciclos de reproducción del virus.

àCiclo lítico: es el realizado por los fagos virulentos. Lisan y matan al hospedador inmediatamente.

àCiclo lisogénico: es el realizado por los fagos atemperados. Pueden permanecer en el hospedador durante mucho tiempo sin matarlo. Su DNA puede integrarse en el cromosoma bacteriano o permanecer en el citoplasma en forma de plásmido. Se replica paralelamente a la bacteria, por ende se hereda. Un fago atemperado integrado se lo denomina profago y a la bacteria que lo alberga se la denomina lisogénica. Esta bacteria tiene la característica de presentar inmunidad frente a fagos del mismo tipo. Cuando se dan determinadas condiciones se lleva a cabo una inducción o activación del profago provocando la entrada al ciclo lítico.

Formas de intercambio de DNA en bacterias: conjugación, transformación, transducción generalizada y especializada. Plásmido F. Bacterias Hfr.

àConjugación:

·         Joshua Lederberg y Edward Tatum descubren esta forma de intercambio de DNA. Realizan un experimento en el cual emplean dos estirpes de Escherichia coli. Ambas auxótrofas para diferentes nutrientes (es decir que no crecen en medio mínimo). Al mezclar ambas estirpes se generan individuos (1 de cada 10x10⁶) que retornan a su condición silvestre y pueden crecer en medio mínimo (restauración de la prototrofia).

·         Para que se establezca conjugación es necesario que haya contacto físico entre las bacterias. Bernard Davis demostró esta exigencia al hacer crecer bacterias en un tubo en U que tenía separado sus brazos por un filtro de poro fino. Permitía el pasaje de sustancias nutritivas pero no de bacterias. En un brazo coloco el auxótrofo A y en el otro B, en medio mínimo. No se retorna a la condición silvestre o protótrofa.

·         William Hayes demostró la unidireccionalidad de la transferencia. Hay una célula que actúa como donante (no sale beneficiada) y la otra como receptora (beneficiada). A su vez para actuar como donante es necesario presentar el factor F, su ausencia genera “esterilidad” y a actuar como receptora. Luego se constató que el factor F es en realidad un plásmido que se transfiere a la bacteria receptora por medio de un poro formado por unas proyecciones denominadas pili.

·         Luca Sforza obtiene una estirpe portadora del plásmido F capaz de producir una alta tasa de recombinantes, la denominó Hfr. Resultado de integrar el plásmido F al cromosoma. Esto provoca que al conjugar no solo pase una cadena del plásmido sino también parte del cromosoma del donante que recombina con el de la receptora.

·         Wollman y Jacob descubren que el cromosoma circular de la estirpe Hfr se trasmite de forma lineal al receptor. La apertura del cromosoma y su transferencia comienzan en un punto situado en el extremo del plásmido F integrado denominado O (origen). Mientras más alejado estén los genes de O menos posibilidad tienen de ser transferidos y tardan más tiempo. La demostración de esto la realizaron con conjugaciones interrumpidas. Considerando los distintos tiempos de pasaje de los genes se pueden construir mapas de ligamiento. El último gen en transferirse es el factor F.

·         Campbell determina que la orientación de integración de F determina la polaridad del cromosoma Hfr. Un extremo es el O (origen) y el otro es F (término). El extremo terminal muy pocas veces se transfiere explicando la poca “masculinidad” generada en receptores.

·         Conclusiones: el factor F se puede encontrar en dos estados, en forma de plásmido libre en el citoplasma o integrado en el cromosoma circular bacteriano. Una partícula genética que presenta estos dos estados se la denomina episoma.

·         En hospitales japoneses se descubrió cepas de bacterias resistentes a distintos antibióticos. El fenotipo se heredaba como un paquete único. El vector que trasmitía resistencia resultó ser un elemento con replicación autónoma similar al factor F y se lo denominó plásmido R. Su transmisión era mediante conjugación.

·         Ver figura 5.15 de 9° ed. a manera de resumen.

àTransformación:

·         La conversión de un genotipo en otro mediante la introducción de material genético exógeno se denomina transformación.

·         Este proceso fue dilucidado por Frederick Griffith investigando sobre Streptococcus pneumoniae.

·         Proceso: una bacteria en el proceso de transformación recoge DNA libre en el medio (puede proceder de una célula muerta o de un medio artificial). Para captarlo presenta en su pared celular complejos de unión a DNA asociados a enzimas que degradan DNA. Mientras la doble hélice empieza a ingresar una de las cadenas es degradada a nucleótidos mientras que la restante es la que se integra al cromosoma circular.

·         Se pueden cartografiar genes empleando la transformación.

àTransducción:

·         Algunos fagos son capaces de movilizar genes bacterianos y transmitirlos de una bacteria a otra por medio de un proceso denominado transducción.

·         Lederberg y Zinder investigaron este fenómeno. El descubrimiento fue similar al explicado con el tubo en U (con el filtro separador) que demostraba la necesidad de contacto para que se lleve a cabo la conjugación. En este caso se colocaron dos bacterias mutantes (Salmonella) auxótrofas para determinados nutrientes, un tipo en cada rama del tubo. Lo paradójico fue que sí hubo recombinación ya que se generó un silvestre que pudo dejar descendencia en el plaqueo en medio mínimo. Como un virus tiene un tamaño considerablemente menor que el de una bacteria esto le posibilitó difundir por el filtro de poro pequeño. Durante el ciclo lítico algunas partículas víricas incorporan genes bacterianos que más tarde se transfieren a otro hospedador.

·         Una transducción generalizada implica que los fagos que la realizan puedan transferir cualquier parte del cromosoma de su hospedador. Ocurre en el proceso de replicación de los fagos dentro de la bacteria. Accidentalmente se empaquetan dentro de la cápside fragmentos de DNA bacteriano.

·         Una transducción especializada implica que el fago solo pueda llevarse consigo partes específicas del cromosoma bacteriano. El fago lambda (temperado) lleva a cabo este tipo de transducción. Se inserta en el cromosoma en su forma de profago. Cuando se induce el ciclo lítico debe escindirse por sus extremos. Hay veces que esto no ocurre con precisión. En este caso parte del cromosoma bacteriano se corta con el profago y a su vez parte del fago queda en el cromosoma.

Mapeo genético en bacterias.

Para mapear genes se puede emplear una conjugación interrumpida de la estirpe Hfr de E. coli. La transferencia del cromosoma circular se inicia por el extremo O. Cuanto mayor es la distancia entre O y un gen marcador más tiempo tardará en ser transferido. Como la conjugación se interrumpe en intervalos de tiempo entonces tendremos descendencia con todos los tipos de genes (marcadores) correspondidos con tiempos específicos. Entonces si un alelo a entra a la bacteria 10 después que el alelo b diremos que ambos están separados por 10 unidades.

Virus, recombinación mapeo.

El experimento ideado por Benzer es una manera de mapear genes. Empleó dos estirpes de fago T4 (rII y rII+) y dos estirpes de Escherichia coli (B y K). Los fagos rII+ (silvestre) se reproducen en los dos tipos de bacteria, B y K. Los fagos rII (mutado) se reproducen sólo en las bacterias B. Su experimento consistió en reproducir fagos rII y observar los eventos de recombinación reversibles (aquellos que retornan a su condición silvestre rII+). Como la frecuencia de recombinación era extremadamente baja ideó el siguiente plan empleando las 2 estirpes de bacterias. Primero empleo mutantes rII (1 y 2) sobre la estirpe B. Se reprodujeron y la descendencia fueron: nuevos mutantes 1, 2 (gran mayoría) y también recombinantes dobles y silvestres (minoría). Estos últimos son los buscados. A continuación se colocó toda la descendencia en el cultivo K. Solo crecieron los silvestres, poniendo en evidencia la recombinación. Aplicando esto al mapeo podemos decir que a medida que aumenta la distancia entre genes mutados los eventos de recombinación serán más frecuentes (obtendremos más silvestres). La misma lógica para genes muy cercanos (obtendremos pocos silvestres). De esta forma podemos predecir distancias.

Transferencia horizontal de DNA por virus.

En un proceso de transducción ocurre una transferencia horizontal de DNA. El vector es un fago que al infectar una bacteria y reproducirse se puede llevar genes o fragmentos de DNA de su hospedador. Al atacar una nueva bacteria se produce la transferencia de DNA horizontal. Como contrapartida una transferencia vertical es aquella que ocurre en el pasaje de la información genética a la descendencia. Es decir que lo que inicialmente fue transferido horizontalmente puede luego pasar a ser transferido a toda la progenie verticalmente.

Utilidad de los mapas genéticos.

v  10º TEORICO: REPLICACIÓN

Estructura del DNA. Modelo atómico de Watson, Crick y Franklin.

àPropiedades:

·         Todas las células del cuerpo tienen básicamente la misma composición genética. Las características estructurales del DNA le confieren la propiedad de una replicación fiel.

·         El DNA tiene un contenido informativo que se emplea para codificar un sinnúmero de proteínas.

·         El DNA puede cambiar. Las mutaciones son la materia prima de la selección evolutiva. A pesar de ello el DNA siempre tiende a mantenerse fiel a su código.

àComposición de nucleótido:

1.       Un grupo fosfato

2.       Un azúcar del tipo desoxirribosa

3.       Una base nitrogenada (púrica: adenina [A] o guanina [G]; pirimídica: citocina [C] o timina [T])

àReglas de Chargaff:

·         La cantidad de pirimidinas y purinas es la misma (A+G=C+T)

·         La cantidad de adenina corresponde con la de timina (A=T). La cantidad de guanina corresponde con la de citocina (G=C).

àAnálisis por difracción:

·         Determinó que la molécula de DNA es helicoidal.

àModelo atómico de Watson-Crick: la estructura de la molécula de DNA está conformada por una doble cadena de nucleótidos que se tuercen formando una doble hélice. Las cadenas se unen mediante puentes hidrógeno que se establecen entre las bases nitrogenadas (3 en C-G y 2 en A-T). Cada cadena está formada por unidades alternantes de azúcar y fosfato unidas por enlaces fosfodiester. Los carbonos del azúcar se numeran del 1’ al 5’. En este último se une el fosfato que a su vez se une al azúcar contiguo en el carbono 3’. Esto define una polaridad. Una cadena corre en sentido 3’-5’ y la otra de forma opuesta, 5’-3’. Son antiparalelas. La forma en que se disponen las bases establece una configuración estable donde se observa un surco mayor y otro menor. En el mayor se asocia a proteínas.  Las cadenas con una proporción alta de C-G son más estables que aquellas de baja proporción, desnaturalizan a una T mayor. Esto se explica por la mayor estabilidad debido a que establecen más puentes de hidrógeno.

Experimento de F.Griffith y Avery que indican que el DNA lleva la información para la elaboración de la proteínas.

àFrederick Griffith fue el investigador que descubrió el principio de transformación bacteriana. Se encontraba estudiando la bacteria Streptococcus pneumoniae, causante de neumonía en humanos pero muerte en ratas. Reconoció distintas cepas con diferente grado de virulencia. Algunas causaban la muerte en ratones y otras no tenían efecto. Estudió particularmente dos cepas, S (lisas, de smooth, tienen cápsula de polisacaridos) y R (rugosas, de rough, sin cápsula). Las primeras ocasionan muerte y las segundas no lo hacen. En uno de sus experimentos hirvió un preparado de cepas S logrando lisarlas y las inyecto en un ratón el cual permaneció vivo. Sin embargo cuando repetía dicho experimento y le adicionaba la cepa R el ratón moría. A su vez cuando recolectaba las bacterias del cadáver observó que eran todas S. De alguna manera las células R estaban recolectando fragmentos de las S (muertas) y esto ocasionaba un cambio en el genotipo. Restaba por saber cuál de los compuestos químicos transferidos modificaba la genética de la cepa R.

àAvery comenzó a destruir químicamente cada uno de los compuestos químicos del lisado de bacterias S y a repetir el experimento. La mezcla solo perdió su poder de transformación cuando se incluyó la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa) que corta el DNA.

àLa demostración que el DNA es el principio transformante fue la primer evidencia de que los genes estaba compuesto por DNA.

àHershey-Chase realizaron un experimento que reafirmó la demostración de que los genes están conformados de DNA. Emplearon fagos T2 y cultivos de Escherichia coli. Su conocimiento previo indicaba que los fagos dirigían la maquinaria metabólica de la célula para desarrollar nuevos fagos. Para lograr eso introducían un material desconocido. Entonces averiguando la naturaleza de dicho material podían determinar el material genético de los fagos. Los candidatos eran las proteínas y el DNA. Marcaron las proteínas de un grupo con azufre radiactivo y al DNA de otro grupo con fósforo radiactivo. La radiografía del primer grupo (con S radiactivo) reveló a grupos de fantasmas fuera de la bacteria, indicando que las proteínas no ingresaban. La radiografía del segundo grupo (con P radiactivo) reveló material dentro de las bacterias. Por ende el fago inyecta DNA y como este se emplea como información para generar nuevos fagos entonces en este material residen los genes.

Replicación semiconservativa y bidireccional, demostraciones. Replicación, actividad de la DNA polimerasa, y otras proteínas en el replicación. Replicación en la cadena adelantada y en la atrasada (fragmentos Okasaki).

àReplicación semiconservativa: cuando el DNA se replica primero debe exponer sus bases y para ello la doble hélice debe abrirse. Cuando ocurre esto los nucleótidos libres en el citoplasma son adicionados según la complementariedad de bases y esto provoca la síntesis de una cadena complementaria en cada una de las cadenas madres. De allí deriva el nombre, ya que se conserva la mitad de la cadena madre y se sintetiza el resto. Sin embargo habían propuestos otros dos modelos de replicación: conservativa (la cadena madre se mantiene y se sintetiza otra paralelamente) y dispersiva (cada cadena hija está conformada por fragmentos nuevos y fragmentos de la madre).

Demostración: Meselson-Sthal investigaron cuál de los tres mecanismos de replicación se llevaba a cabo. Elaboraron el siguiente experimento. Emplearon un isótopo pesado de ¹⁵N (el normal es ¹⁴N). Colocaron a bacterias Escherichia coli creciendo en un medio enriquecido con este isótopo. Luego de varias generaciones el DNA de las bacterias estaba completamente marcado con ¹⁵N. El siguiente paso fue separar un grupo de bacterias para su estudio. Se las colocó en un medio con nitrógeno normal. La primera generación emplearía la nueva fuente replicando su DNA con el nitrógeno normal. Lo mismo con la segunda generación. Para distinguir cuál modelo de replicación estaba funcionando realizaron centrifugaciones en CsCl para determinar las densidades. El patrón de bandas fue el esperado para la replicación propuesta por Watson-Crick (ver figura en libro, pag 277).

àReplicación bidireccional: cuando la doble hélice se separa para replicarse se forma una horquilla de replicación. Debido a la polaridad de cada cadena tendremos en la horquilla una que corre en dirección 5’-3’ y la otra 3’-5’. Un grupo de enzimas cataliza la unión de nucleótidos a la cadena madre. La DNA pol III es la encargada de la síntesis. Adiciona nucleótidos en dirección 5’-3’. Esto genera un inconveniente. Una de las cadenas sintetizará en la dirección de avance (cadena adelantada) mientras que la otra sintetiza en la dirección contraria (cadena retrasada). En el primer caso no se presenta problema ya que síntesis y avance van paralelos. En el segundo caso se soluciona sintetizando la cadena de a pedazos denominados fragmentos de Okasaki (1000-2000 nucleótidos). Para iniciar la síntesis de cualquiera de las dos cadenas (o de cada fragmento) es necesario un cebador o primer. Una enzima denominada primasa (RNA pol) inserta una serie de ribonucleótidos (8-12) que marcan el inicio de síntesis de la DNA pol III. Como el material adicionado es de otra composición química (RNA) luego es retirado por la DNA pol I. Los fragmentos de Okasaki luego se unen gracias a la DNA ligasa. Tanto la DNA pol III y la I tienen actividades exonucleasa 3’-5’ (la DNA pol I también 5’-3’, saca los primers).

àReplisoma: gran complejo nucleoproteico que coordina las actividades en la horquilla de replicación. Está conformado por una Holoenzima pol III que presenta dos núcleos catalíticos (uno para la cadena adelantada y otro para la retrasada) y muchas proteínas accesorias. La cadena retrasada forma un bucle para ingresar al sitio catalítico del replisoma, de esta forma se mantiene el avance. Las abrazaderas beta actúan como guantes que mantienen unidas la DNA pol III al DNA. Toda esta configuración en molde fijo se denomina procesiva (el modelo clásico de DNA pol III libre se denomina distributivo) y es la que confiere rapidez y coordinación en la replicación.

Origen de replicación en eucariotas y en procariotas. 

àProcariotas: presentan un solo origen de replicación en su cromosoma circular. En Escherichia coli se denomina oriC. Es una región del cromosoma que presenta 5 grupos de 13 pares de bases cada uno denominadas cajas de DnaA. Adyacente a esta formación se encuentra una zona rica en AT que será el lugar de formación de la futura horquilla. El primer paso es el montaje en todo el oriC de proteínas DnaA. Esto determina la zona de replicación y apertura de las cadenas. A medida que se forma la horquilla se acoplan más DnaA y luego ingresan las helicasas. En un paso posterior se adhieren los replisomas y comienza el avance de la replicación.

àEucariotas: presentan múltiples orígenes de replicación en cada uno de sus cromosomas. En eucariotas sencillos la zona de inicio es similar a la de procariotas. Presenta una secuencia de unión a proteínas reguladoras adyacente a la zona rica en AT donde se formará la horquilla. La proteína ORC reconoce el origen. Recluta dos proteínas cdc6 y cdt1. Todo el complejo recluta a su vez a helicasas y los replisomas. En eucariotas complejos el proceso es más complicado y todavía no se encuentra dilucidado. Los ORC no se unen a secuencias específicas sino que se asociarían a proteínas intermediarias acopladas al cromosoma. Estas resultan claves a la hora de regular la fase S del ciclo celular y la desincronización en la replicación de eu y heterocromatina.

Las múltiples horquillas avanzan en sus dos direcciones hasta alcanzar otras horquillas adyacentes y fusionarse. Esto ahorra mucho tiempo y permite replicar con gran rapidez el cromosoma eucariótico.

A medida que se lleva a cabo la replicación paralelamente proteínas accesorias al replisoma reconstituyen los nucleosomas a partir de histonas viejas o sintetizadas y transportadas por CAF-1 que luego se une a PCNA (abrazadera beta eucariótica).

Regulación del ciclo celular y su relación con le replicación del DNA.

Ver teórico 2

Replicación de los telómeros.

àCuando un cromosoma finaliza la replicación los extremos de la cadena retrasada no pueden replicar los nucleótido del primer. Esto se explica por la dirección de replicación de la DNA pol que es 5’-3’. Esto al mismo tiempo explica por qué la adelantada no sufre dicho problema. Esta pérdida puede resultar insignificante en las primeras replicaciones, pero luego de varias se pueden perder genes de funcionamiento vital. Para solucionar dicho inconveniente la célula presenta enzimas denominadas telomerasas que agregan nucleótidos en tándem y no codificantes que evitan las pérdidas de nucleótidos sí codificantes. La telomerasa presenta una secuencia de RNA (palíndromo) que sirve para adherir nucleótidos al extremo 3’ (el de la adelantada). De esta forma se “hace espacio” para que se pueda insertar un nuevo primer (ahora sobre secuencia silenciosa). Sobre el actuara la DNA polimerasa y ligasa para unir el nuevo fragmento de Okasaki.

v  11º TEORICO: TRANSCRIPCION

Características de los RNA.

àPropiedades:

·         Es una molécula de una sola cadena lineal de nucleótidos. Esto le confiere flexibilidad y la posibilidad de conformar múltiples estructuras tridimensionales. Sus bases pueden llegar a aparearse entre sí.

·         Sus nucleótidos están conformados por el azúcar ribosa. Sus carbonos se enumeran igual que ocurre en el DNA y los enlaces son los mismos.

·         Las bases nitrogenadas son las mismas que en el DNA salvo el cambio de timina (T) por uracilo (U). Esta base pirimidica (U) puede aparearse con adenina (A) durante la transcripción. Además puede aparear con guanina (G) durante el plegamiento.

·         Puede actuar como catalizador de una reacción biológica. Cuando cumple esta acción se lo denomina Ribozima.

Tipos de RNA.

àRNA mensajero: tipo de RNA al cual se transcribe la información contenida en los genes del cromosoma en forma de DNA. Es un intermediario que lleva la información traducida desde el núcleo al citoplasma donde es leída por otro tipo de RNA y traducida en aminoácidos que forman proteínas.

àRNA funcional: son secuencias de RNA que cumplen una función determinada en la célula y no actúan como reservorio de información para formar proteínas.

·         RNA transferencia (tRNA): portan los a.a. específicos y presentan un anticodon que complementa con un triplete del mensajero.

·         RNA ribosómico (rRNA): forman estructuras denominadas ribosomas que actúan de soporte al proceso de lectura del RNA mensajero, ensamblaje del RNA de transferencia y producción de proteínas.

·         RNA nuclear pequeño (snRNA): funcionan como sistema adicional en el procesamiento de transcritos de RNA en células eucariotas. Algunos participan en el splicing formando parte del spliceosome.

·         MicroRNA (miRNA): regulan la expresión génica y por ende la cantidad de proteína traducida.

·         RNA de interferencia pequeño (siRNA): ayudan a proteger la integridad del genoma en animales y plantas. Inhibe la producción de virus.

Enzima involucrada en transcripción, forma en que trabaja. Cadena molde y cadena codificante.

àTranscripción:síntesis de RNA a partir de DNA. Las dos cadenas de DNA se separan localmente y se emplea una de ellas (siempre la misma para cada gen, cadena molde) para elaborar el RNA correspondiente, por ello se dice que es asimétrica.  Por complementariedad de bases se comienza a sintetizar el ARN de acuerdo al orden de nucleótidos expuestos de DNA. La enzima RNA polimerasa se encarga de esta función. Adiciona nucleótidos en dirección 5’-3’. El RNA resultante tiene los mismas bases que la cadena de DNA 5’-3’ (no usada para transcribir, denominada cadena codificadora) salvo por la sustitución de T por U.

Etapas: iniciación, elongación, terminación.

Estructuras del gen: promotor, secuencias consenso en todos los promotores, primer codón en todos los RNA que dan lugar a proteínas, secuencias de terminación, o mecanismo de terminación, exones, intrones. Procesamiento de RNA: corte y empalme de intrones, corte y empalme diferencial, capping, polyadenalinación.

àEstructura del gen:

ü  Procariotas: el promotor es una zona que se ubica adyacente a la codificante. Participa en la regulación de la transcripción. La cadena de DNA codificadora tiene la misma dirección que la de RNA, 5’-3’. El promotor se ubica en la posición 5’ de la cadena codificadora. Una secuencia consenso es una serie de bases no idénticas que se ubican en la misma posición del promotor y que cumplen una misma función. A pesar de no ser fieles unas a las otras puede establecerse una serie que tiende a mantener su forma. La parte del gen que codifica la proteína comienza con una secuencia ATG denominada primer codón. A pesar de esto el sitio de inicio de la transcripción se encuentra aguas arriba (más cerca del promotor) y se la denomina región 5’ no traducida. La enzima que reconoce al promotor se denomina holoenzima de la RNA polimerasa, está formada por 6 unidades. Interesa una de ellas denominada sigma que ser une a las regiones -35 y -10 del promotor (regiones que corresponden a las secuencias consenso). Además esta subunidad abre las hebras y hecho esto se libera. En la elongación se genera una burbuja de transcripción, en el extremo de avance el DNA se desenrolla mientras que en el otro el DNA se re-enrolla. Los nucleótidos (ribonucleótidos) se toman del medio y se adicionan a la cadena molde formando un hibrido momentáneo entre RNA-DNA. La terminación se lleva a cabo por dos mecanismos, uno intrínseco y el otro mediado por rho. El mecanismo intrínseco es directo, se reconoce una zona rica en C-G y luego en A. Esto codifica un RNA que forma un bucle (mucho C-G) que traba y corta la otra región con mucho A-U que es débil (2 dobles enlaces). La forma dependiente de rho no forma bucle ni presenta residuos U. El RNA tiene un sitio rut que es reconocido por rho para realizar el corte.

ü  Eucariotas: la transcripción la llevan a cabo tres polimerasas diferentes, RNA pol I (transcribe genes de rRNA), II (transcribe genes de mRNA y snRNA) y III (transcribe genes de tRNA, snRNA y 5S sRNA). Iniciación: antes del inicio de la transcripción son necesariso GTF, factores de transcripción generales. Cuando ocurre esto puede acoplarse la RNA pol II. La suma de estos dos eventos constituyen el complejo de preiniciación (PIC). Al igual que en procariotas existen secuencias consenso en el promotor. En la posición -30 se encuentra la TATA box a la cual se une a un GTF denominado TBP (el primero en unirse). Elongación y terminación: es esencialmente similar a la de procariotas. Se forma una burbuja de replicación. Difiere en que en eucariotas se lleva a cabo un procesamiento debido a que el mRNA debe exportarse al citoplasma. El procesamiento puede separarse en una parte cotranscripcional (simultaneo a la transcripción) y postranscripcional (terminada la transcripción). La RNA pol presenta una “cola” de aminoácidos denominada CTD, además de cumplir una función en el inicio de la transcripción (liberación de GTF) cumple un papel en el procesamiento. Según su estado fosforilada/desfosforilada determina el tipo de proteínas que pueden unirse. Las primeras enzimas que une son las asociadas a la adición de la caperuza. Una estructura de protección y señalización en la traducción. Cuando el mRNA mensajero está por concluir su transcripción llega a una secuencia conservada denominada señal de poliadenilación. Esto marca el corte por una enzima y la adición de la cola de poli A por parte de enzimas acopladas a CTD. Un intrón es una región no codificante mientras que un exón es una región codificante. Ambas se encuentran intercaladas. El corte y empalme (splicing) une las regiones codificadoras del RNA o exones de manera que al salir del núcleo todo el transcrito puede codificar una proteína funcional.

àSplicing alternativo: al transcribirse el ADN a ARNm se obtiene un transcrito primario de ARN o pre-ARNm que incluye intrones y exones. Para que este pre-ARNm de lugar a un ARNm debe sufrir un proceso de maduración del ARNm, que consiste, básicamente, en eliminar todos los intrones. Este proceso se denomina splicing y no actúa siempre de la misma manera. Esta versatilidad en su accionar es lo que genera mRNA diferentes y por ende proteínas distintas. En base a esto podemos decir que un gen puede codificar para más de una proteína gracias al splicing alternativo llevado a cabo en la traducción. Las proteínas están formadas por dominios funcionales que a menudo se codifican en diferentes exones. Bajo este presupuesto el empalme alternativo del pre-mRNA puede generar múltiples proteínas denominadas isomorfas, es decir proteínas que morfológicamente son muy similares pero su funcionalidad difiere.

Diferencias entre eucariotas y procariotas en la transcripción.

àEstado basal: activo procariotas, inactivo eucariotas.

àEl DNA de procariotas es más simple por ende requiere para traducir un tipo de RNA pol más simple. En eucariota debido a la complejidad de su DNA se recluta diversos tipos de polimerasa especializados.

àProcariota: mRNA no madura, se traduce mientras se transcribe. En eucariota se traduce en otro sitio y requiere madurar para su transporte.

àProcariota: el mRNA puede codificar más de una proteína (policistrón). En eucariota el mRNA codifica una sola proteína. Considerando el splicing alternativo obtendremos una gama de proteínas de un mismo mRNA.

v  12º TEORICO: TRADUCCION

Proteínas, secuencia primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Enlace peptídico, cómo se produce.

àProteínas: principales determinantes de la estructura y función biológica. Polímero compuesto por monómeros denominados aminoácidos. Un aminoácido está conformado por un grupo carboxilo, amina y una cadena lateral, todos unidos a un átomo de carbono central. Un aminoácido se puede unir a otros dos mediante enlace covalente denominado enlace peptídico. Se establece entre el grupo funcional carboxilo y el amino. Durante la reacción se forma una molécula de agua. Una cadena polipeptídica tendrá bajo este razonamiento un extremo carboxilo y otro amino.

àEstructura:

·         Primaria: secuencia lineal de aminoácidos. Está determinada por el tipo y el orden de los aminoácidos. La cadena lateral que determina a cada aa reviste mucha importancia y condiciona las demás estructuras.

·         Secundaria: plegamientos específicos de la cadena polipeptídica o estructura primaria. La fuerza que mantiene la estructura es fundamentalmente el puente de hidrógeno. Se puede llegar a dos configuraciones.

Ø  Hélice alfa: En esta estructura la cadena polipeptídica se desarrolla en espiral sobre sí misma debido a los giros producidos en torno al carbono beta de cada aminoácido. Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno intracatenarios formados entre el grupo el grupo -C=O del aminoácido "n" y el -NH del "n+4" (cuatro aminoácidos más adelante en la cadena). Un ejemplo particular es la Hélice de colágeno: una variedad particular de la estructura secundaria, característica del colágeno, proteína presente en tendones y tejido conectivo.

Ø  Hoja plegada beta: Cuando la cadena principal se estira al máximo que permiten sus enlaces covalentes se adopta una configuración espacial denominada cadena beta. Algunas regiones de proteínas adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre sí estableciendo uniones mediante enlaces de hidrógeno intercatenarios. Todos los enlaces peptídicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo así gran estabilidad a la estructura. La forma en beta es una conformación simple formada por dos o más cadenas polipeptídicas paralelas (que corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en direcciones opuestas) y se adosan estrechamente por medio de puentes de hidrógeno y diversos arreglos entre los radicales libres de los aminoácidos. Esta conformación tiene una estructura laminar y plegada, a la manera de un acordeón.

·         Terciaria: modo en el que la cadena polipeptídica se pliega en el espacio. La estructura terciaria posee cantidades variables de helices-alfa y hoja plegada beta y otras con una estructura flexible que puede cambiar al azar. La estructura terciaria de las proteínas está estabilizada por enlaces puentes disulfuro entre Cys, puentes de hidrógeno entre cadenas laterales, interacciones iónicas entre cadenas laterales, interacciones de van der Waals entre cadenas laterales y el efecto hidrófobo (exclusión de las moléculas de agua, evitando su contacto con los residuos hidrófobos, que quedan empaquetados en el interior de la estructura). 

·         Cuaternaria:algunas proteínas contienen múltiples cadenas de polipéptidos, dando como resultado la estructura cuaternaria. Cada una de las partes se denominan subunidades. Si está conformada por dos del mismo tipo es un homodímero, si son de distinto tipo heterodímero. La hemoglobina tiene cuatro subunidades, dos alfa y dos beta, entonces decimos que es un heterotetrámero.Las estructuras cuaternarias se unen por los mismos tipos de uniones químicas encontradas en la estructura terciaria, incluyendo una variedad de uniones débiles y de los puentes de disulfuro.

Código genético: no solapante, triplete de base, degenerado (más de un codón para un aac. + Efecto wobble o tambaleo), descifrado (experimentos que determinaron el código), universal.

àCódigo genético:

Ø  No solapado: esto implica que cada aminoácido está determinado por un triplete el cual está representado por 3 bases. El hecho de estar no solapado quiere decir que el primer triplete codifica un aminoácido y el segundo otro y así sucesivamente. Es decir que un triplete no considera las bases del antecedente. La demostración fue a partir de una proteína alterada por una mutación, esto generaba el cambio en un solo aminoácido. En un código solapado incluiría a más de uno.

Ø  Triplete de bases y código degenerado: como su nombre lo indica está formado por 3 bases. Como el RNA puede tener A, G, C y U entonces las posibilidades de formar tripletes son 4³=64. Como son 20 los aminoácidos entonces debe haber tripletes que codifiquen para el mismo aminoácido o tripletes que codifiquen otras acciones (inicio, finalización). Crick demostró este ordenamiento de a tres en las bases codificantes. Realizando mutaciones al fago T4 en su gen rII (el mismo que Benzer) pudo corroborar que únicamente tres adiciones (o tres deleciones) reconstituyen el marco de lectura (actúa como supresor).

Por ejemplo:

Secuencia:   AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA

Adición 1:    AGA AGA  TAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG AAG

Adición 2:    AGA AGA  TAG ACA GAA  GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA

Adición 3:    AGA AGA  TAG ACA GATAGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA AGA

 En este caso la tercera mutación por adición tiene un efecto supresor sobre las otras dos.

               Al ser 3 las mutaciones necesarias se pone en evidencia que la unidad codificadora es el

triplete.

Ø  Descifrando el código: para establecer cual aa codifica cada triplete fue necesario manipular el mRNA. Se pudo elaborarlo sintéticamente. Esto se lleva a cabo mezclando ribonucleótidos junto a una enzima denominada polinucleótido fosforilasa. Luego se emplea la maquinaria de síntesis de Escherichia coli y se observan las proteínas producidas.

Ø  Universalidad: El código genético es compartido por todos los organismos conocidos, además de virus y organelos, aunque pueden aparecer pequeñas diferencias. Así, por ejemplo, el codón UUU codifica el aminoácido fenilalanina tanto en bacterias, como en arqueas y en eucariontes. Este hecho indica que el código genético ha tenido un origen único en todos los seres vivos conocidos.

Gracias a la genética molecular, se han distinguido 22 códigos genéticos, que se diferencian del llamado código genético estándar por el significado de uno o más codones. La mayor diversidad se presenta en las mitocondrias, orgánulos de las células eucariotas que se originaron evolutivamente a partir de miembros del dominio Bacteria a través de un proceso de endosimbiosis. El genoma nuclear de los eucariotas sólo suele diferenciarse del código estándar en los codones de iniciación y terminación.

RNAt, características moleculares, enzimas que hacen la unión del aac. al RNAt.

àtRNA: formado por una sola cadena de RNA plegada en forma de trébol, con cuatro tallos y tres lóbulos. El lóbulo central porta el anticodon, estructura que complementa con el codón del mRNA. La enzima aminoacil-tRNA sintasa une como su nombre lo indica aa con el tRNA. Hay varios tRNA uno por cada aa. Hay 20 tipos de sintasas para cada aa.Esta enzima es de suma importancia ya que un error en la elección del aa provoca q este se inserte de todas manera en la cadena polipeptídica (el tRNA es “analfabeto”). El tambaleo consiste en un alineamiento doble que puede realizar el tercer nucleótido del anticodon. Esto provoca que un tRNA con esta propiedad pueda unirse a dos codones que se diferencien en su 3 base.

Ribosomas, estructura molecular en procariotas y eucariotas.

àRibosoma: complejos macromoleculares de proteínas y ácido ribonucleico (ARN) que se encuentran en el citoplasma, en las mitocondrias, en retículo endoplasmatico y en los cloroplastos. Son un complejo molecular encargado de sintetizar proteínas a partir de la información genética que les llega del ADN transcrita en forma de ARN mensajero (ARNm). Se los puede definir como máquinas biológicas ya que está compuesto por complejos de subunidades que realizan funciones celulares específicas, ligado a su alta precisión y rapidez. Compuesto por 2 subunidades, una pequeña y otra mayor. Las unidades se caracterizan por su coeficiente de sedimentación en unidades Svedberg [S]. En procariotas las subunidades son de 30S y 50S (cuando se asocian 70S). En eucariotas las subunidades son de 40S y 60S (cuando se asocian 80S). Además difieren en la cantidad de proteínas y tipos de rRNA en cada subunidad. Funcionalmente son muy similares. El rRNA conforma 2/3 de la masa ribosómica y 1/3 está formado por proteínas. El rRNA es el principal actor (ribozima) y esta asistido por proteínas.

En la subunidad menor se acopla el mRNA y en la mayor se producen los enlaces peptídicos y el crecimiento de la cadena polipeptídica. Se reconocen tres sitios en el ribosoma. El sitio aminoacil (A) es donde se une el tRNA entrante que complementa su anticodon con el codón del mRNA. El sitio peptidil (P) aloja también a un tRNA por complementación. En este sitio crece el polipéptido. El sitio de salida (E) contiene a un tRNA desacilado que debe ser liberado. A su vez se reconocen dos centros, decodificador (asegura el acople certero del tRNA en el sitio A) y el peptidiltransferasa (cataliza la formación del enlace peptídico).

Descripción de la traducción en procariotas y eucariotas: inicio, elongación, terminación.

àTraducción:

v  Iniciación: consiste en el acople del primer aminoacil-tRNA en el sitio P del ribosoma.

Ø  Procariotas: el primer aminoácido transportado es la N-formilmetionina (el grupo N.formil luego se libera). Es acarreado por un tRNA especial de iniciación. El codón de iniciación es AUG. Está precedido por la secuencia Shine-Dalgarno aguas arriba de la secuencia de iniciación. Se requieren tres proteínas o factores de iniciación IF1, IF2 (aseguran el sitio de iniciación) y IF3 (mantiene la subunidad menor sin acople). Cuando IF3 se libera se produce el acople a la subunidad mayor. Debido a la ausencia de compartimiento nuclear la traducción puede efectuarse simultáneamente a la transcripción. Entonces hay coincidencia temporal y espacial.

Ø  Eucariotas: la transcripción y traducción tienen diferencia temporal y espacial. El mRNA sufre un procesamiento para abandonar el núcleo. Estas modificaciones deben eliminarse para exponer las bases a la hora de traducir a proteínas. Factores de iniciación cumplen dicha función. La asociación en la caperuza del IF, la subunidad menor 40S y el tRNA iniciador forman el complejo de iniciación. Luego se desplaza al triplete AUG donde complementa el tRNA iniciador. Luego se acopla la subunidad mayor 60S previa liberación de IF. No hay secuencia de Shine-Dalgarno.

v  Elongación: el sitio P se encuentra inicialmente ocupado por el tRNA que porta metionina. El sitio A ahora es ocupado por un complejo ternario formado por el tRNA complementario al siguiente triplete, un aminoácido y un factor de elongación EF-Tu. Cuando este factor se libera el aa metionina se libera y forma un enlace peptídico con el aa recién ingresado. A continuación ingresa un nuevo EF-G que ocupa el sitio A y por ende desplaza a los tRNA a los sitios contiguos. El tRNA iniciador “vacio” se libera y el tRNA con la cadena aa₁-met ocupa el sitio P. Cuando el EF-G se libera el sitio A queda desocupado y el ciclo se repite.

v  Terminación: cuando el sitio A llega a un codón de terminación (UGA, UAA, UAG) el ciclo se detiene. Estos codones no acoplan a ningún tRNA sino que son reconocidos por factores de liberación, RF. El ingreso de la proteína provoca que el sitio peptidiltransferasa incluya una molécula de agua que actúa hidrolizando el extremo de la cadena polipetídica y promoviendo su liberación.

Mimetismo molecular qué es.

àSimilitud en los determinantes antigénicos de dos moléculas concretas. Puede ocurrir que un microorganismo presente un mimetismo molecular con una molécula de un hospedador inmunocompetente. En tal caso, los anticuerpos producidos contra el microorganismo reaccionarían con la molécula del hospedador, originándole una enfermedad autoinmune.

Modificaciones post-traduccionales de proteínas, ejemplos.

àSucesos postraduccionales:

Ø  Plegamiento de la proteína dentro de la célula: para que una proteína cumpla su función debe plegarse adquiriendo su estructura nativa. Las cadenas polipeptídicas nacientes se pliegan con ayuda de chaperonas. Son proteínas que forman complejos con múltiples subunidades (maquinas chaperoninas de plegamiento) que actúan brindando un ambiente adecuado para el plegamiento a la cadena polipeptídica.

Ø  Modificaciones postraduccionales de las cadenas laterales de los aa:

o    Fosforilación/desfosforilación: por medio de quinasas y fosfatasas se adhiere o retira un grupo fosfato de ciertos grupos de aminoácido que conforman a las proteínas. Esto actúa como interruptor biológico reversible que puede controlar la forma de la proteína y por lo tanto su funcionalidad (por ejemplo puede esconderse o exponerse un sitio activo).

o    Ubiquitinización: la ubiquitina es una proteína que forma cadenas que marcan a su vez a otras proteínas para ser degradadas en una estructura en forma de barril denominada proteosoma.

Ø  Destino de las proteínas: si bien todas las proteínas se sintetizan en los ribosomas del citoplasma su destino puede ser muy diverso. La manera en la que determinan el destino es a partir de una secuencia señal (péptido señal) ubicada en el extremo amino terminal de la cadena polipeptídica. Las proteínas que deben viajar al núcleo debes ser transportadas hacia allí por otras proteínas que reconocen secuencias de localización nuclear (NLS). Esta secuencia se ubica en el seno y no se pierde. En cambio el péptido señal sí se escinde.

v  13º TEORICO: EXPERIMENTO DE BENZER con el fago T4 en el locus rII.

Demostración de Benzer que la unidad de mutación y recombinación es la base, y que la unidad funcional es el cistron-gen.

Empleó dos estirpes de fago T4 (rII y rII+) y dos estirpes de Escherichia coli (B y K). Los fagos rII+ (silvestre) se reproducen en los dos tipos de bacteria, B y K. Los fagos rII (mutado) se reproducen sólo en las bacterias B. Su experimento consistió en reproducir fagos rII y observar los eventos de recombinación reversibles (aquellos que retornan a su condición silvestre rII+). Como la frecuencia de recombinación era extremadamente baja ideó el siguiente plan empleando las 2 estirpes de bacterias mutantes. Primero empleo mutantes rII (1 y 2) sobre la estirpe B. Se reprodujeron y la descendencia fueron: nuevos mutantes 1, 2 (gran mayoría) y también recombinantes dobles y silvestres (minoría). Estos últimos son los buscados. A continuación se colocó toda la descendencia en el cultivo K. Solo crecieron los silvestres, poniendo en evidencia la recombinación. Los mutantes 1 y2 tienen alterado el gen rII en distintas partes. Para lograr el estado silvestre entonces debe haber ocurrido un recombinación de tipo intragénica (diferente de le intergénica que se vio anteriormente). Con esto Benzer pudo comprobar que la unidad de mutación no es el gen sino un elemento más chico que lo compone. Luego se descubrió que esos elementos son las bases de los nucleótidos.

Test de complementación: Prueba cis-trans.

v  14º TEORICO:  MUTACION EN EL GEN

Mutaciones en el gen; cambios de base, cambio en el número de repeticiones de base.

àMutación: cambio o alteración en la información genética de un organismo que es heredable y que puede o no producir un cambio en el fenotipo (hay mutaciones silenciosas).

Mutaciones espontáneas e inducidas. Mutaciones somáticas, mutaciones en la línea germinal.

àMutación:

Ø  Espontanea: la mutación es un proceso aleatorio. Cualquier alelo de cualquier célula puede mutar en cualquier momento. Entre los mecanismo de mutación espontanea se encuentran los errores (poco frecuentes pero al fin errores) en la maquinaria replicadora del DNA (sustituciones como transición, transversión; indel). El DNA es una estructura lábil susceptible a un entorno celular hostil.Inserción de elementos transponibles. Lesiones espontaneas, ROS.

Ø  Inducida: agrupa a aquellas mutaciones que son provocadas por el medio ambiente, incluyendo a las inducidas deliberadamente en el laboratorio o aquellas que ocurren en el medio ambiente cotidiano. La exposición a un mutágeno provoca mutaciones en el DNA y a este proceso se lo denomina mutagénesis.

Mecanismos de mutagénesis:

§  Reemplazar (Incorporación de análogos de base): un análogo de base es un compuesto químico que debido a su similitud puede reemplazar una base. Una vez incluido éste puede emparejar de manera distinta a la base original.

§  Alterar (Emparejamiento erróneo específico): son compuestos químicos que alteran la estructura de una base como la adición de grupos alquilo.

§  Dañar (Daños en la base): provocan que una base deje de emparejar provocando un bloqueo en la replicación. Pueden ser provocadas por luz UV (genera alteraciones en el DNA, fotoproductos), radiación ionizante (generando intermediarios, radicales libres o especies reactivas de oxígeno o bien directamente sobre el DNA).

§  Sustancias intercalantes: se interponen entre las bases y causan inserciones o deleciones.

Tasa de mutación espontánea e inducida.

àEs el número de mutaciones que se producen por unidad de tiempo, las unidades de tiempo que se emplean habitualmente son el período correspondiente a la vida de una célula, de un organismo (generación) o de una división celular. Como puede observarse, las unidades de tiempo corresponden a unidades biológicas.

Tipos de mutaciones puntales en el gen: transiciones, transversiones, mutaciones indel. Consecuencias en las proteínas de las mutaciones puntales en el gen: mutaciones silenciosas, mutaciones sin cambio de sentido, mutaciones con cambios de sentido conservativo y no conservativo, mutaciones sin sentido, mutaciones de cambio del cuadro de lectura.

àMutación puntual: alteración de un único par de bases de DNA o a un número pequeño de bases adyacentes.

Ø  Transición o transversión: un par de bases es sustituido por otro. En la transición la sustitución es de bases similares químicamente (ej. purina x purina). En la transversión la sustitución es de bases químicamente diferentes (ej. Purina x pirimidina).

o    Mutación sinónima (silenciosa): el codón que se altera determina el mismo aminoácido que el tipo salvaje.

o    Mutación de cambio de sentido (conservadora): el codón alterado determina un aminoácido químicamente similar al salvaje.

o    Mutación de cambio de sentido (no conservadora): el codón alterado determina un aminoácido químicamente diferente al salvaje.

o    Mutación sin sentido: el codón alterado determina la finalización prematura de la cadena.

Ø  Indel:

o    Inserción de base:

§  Mutación de desplazamiento del marco: la adición de una base provoca el desplazamiento del marco de lectura.

o    Deleción de base:

§  Mutación de desplazamiento del marco: la supresión de una base provoca el desplazamiento del marco de lectura.

Mutaciones en regiones no codificantes, consecuencias de este tipo de mutaciones.

àIncluye las mutaciones acontecidas en todas aquellas regiones que se encuentran rodeando a las zonas codificadoras. Pueden cambiar el patrón de expresión de un gen en lo que respecta a la cantidad de producto o a la respuesta ambiental. No alteran al producto en su constitución. Pueden bloquear la producción de un producto determinado (ej. Impidiendo la función de RNA pol por mutación del sitio de unión).

Causas de las mutaciones puntuales: errores de replicación: cambios de una base o cambios tautoméricos, modificación de una base, cambios de fase (indel); daños fortuitos en el DNA: depurinización, deaminación, cambios oxidativos, dímeros de timina (fotoproductos).

àTautómero: isómeros que difieren en la posición de sus átomos o enlaces entre ellos. En las bases nitrogenadas y sus emparejamientos observamos las configuraciones ceto (complementación normal) y las formas imino y enol (complementación anormal). Esta posibilidad de emparejamientos erróneos genera desplazamientos tautoméricos que introducen mutaciones

en la replicación del DNA. Es un tipo de mutación de transición. La DNA pol III puede corregir y reducir su riesgo.

àLesiones espontaneas:

Ø  Depurinización: pérdida de una base púrica (G o A) por ruptura del enlace glucosídico.

Ø  Deaminación: pérdida del grupo funcional amina (la citosina pasa a uracilo).

Ø  Cambios oxidativos: son causados por especies reactivas de oxígeno que se producen durante el metabolismo celular aerobio.

Mecanismos de reparación del DNA: corrección de la DNA pol III por actividad exonucleasa; reparación sin escisión del DNA; reparación con escisión del DNA, mecanismo de reparación SOS.

àCorrección de la DNA pol III y I: ambas enzimas tienen actividad exonucleasa correctoras.

àReparación sin escisión del DNA: 

§  Reparación postreplicativa, reparación de emparejamientos erróneos: se reconocen pares de bases mal emparejadas, esto lo lleva a cabo MutS. Se determina cuál de las dos es la incorrecta, esto lo realiza MutH. La base incorrecta corresponde a la cadena recién sintetizada que a su vez se reconoce por la ausencia de marcadores epigenéticos (metilación de ciertas bases). Se escinde la base incorrecta y se realiza la síntesis de reparación.

àReparación con escisión del DNA: todos se basan en el mismo sistema, eliminar los nucleótidos dañados (la hélice queda abierta por una cadena momentaneamente) y luego usar la cadena restante como molde para reconstruir la zona por complementariedad de bases.

§  Reparación por escisión de bases (daño no voluminoso): una glicosilasa reconoce y rompe la unión glucosídica (base-azucar) para eliminar la base. Ahora el sitio se denimina AP (apurínico o apirimídico). Una endonucleasa realiza un corte en la cadena dañada. Una dRpasa elimina un tramo de DNA. La DNA pol sintetiza el fragmento faltante. La ligasa sella el corte.

§  Reparación por escisión de nucleótidos (daño voluminoso): estos daños bloquean la horquilla de replicación y transcripción. Proteínas especiales reconocen la zona afectada. Activan factores de transcripción que traducen proteínas reparadoras. Se reclutan y acoplan en la zona formando un complejo multiproteico. Se corta la cadena dañada inclusive varios nucleótidos aguas arriba y abajo. La RNA pol usando de molde la cadena no dañada recupera el fragmento. La ligasa une los cortes.

àReparación SOS: este sistema se induce como respuesta de emergencia para impedir la muerte de la célula en el caso de que se produzca un daño significativo de DNA. Cuando la DNA pol III llega a un sitio con DNA dañado se detiene. En caso de retenerse por un tiempo prolongado esto determina una señal de muerte. Para evitarlo se activa la reparación SOS. Asociado a la polimerasa se encuentra la proteína PCNA. Su ubiquitinización es la señal que determina el cambio de la DNA pol III por una polimerasa de bypass. Esta nueva polimerasa puede tolerar la mutación y proseguir la síntesis por un tiempo breve, luego de eso es reemplazada por la pol III. Una característica es que el fragmento sintetizado por la pol de bypass es propenso a presentar muchos errores. Si bien esto es negativo debemos considerar que a cambio se evitó la señal de muerte de la célula.

Reversión: retromutación, mutación supresora.

àReversión: restauración total o parcial del fenotipo normal (apariencia externa, actividad proteica) a partir de un individuo mutante.

àReversión genotípica:

La reversión genotípica se puede conseguir de dos maneras:

·         Retromutación (en sentido estricto): consiste en recuperar la secuencia exacta de nucleótidos en el ADN.

·         Mutación supresora: es una mutación secundaria que restaura total o parcialmente la función pérdida.

àRetromutación: consiste en recuperar la secuencia exacta de nucleótidos en el ADN, un ejemplo de esta situación sería: AAA (lys)→GAA(glu)→AAA(lys).

A veces también se habla de retromutación en sentido funcional, de manera, que se recupera la actividad enzimática normal pero no se recupera la secuencia original de nucleótidos en el ADN, por ejemplo: UCC(ser)→UGC(cys)→AGA(ser). Sin embargo, el concepto de retromutación funcional no se diferencia del concepto de mutación supresora y puede inducir a error.

àMutación supresora: es una mutación secundaria que restaura total o parcialmente la función pérdida.

§  Mutación Supresora intragénica: la segunda mutación afecta al mismo gen que la primera.

§  Mutación supresora intergénica: la segunda mutación afecta a un gen distinto al que afectó la primera mutación.

Tipos de mutaciones según su consecuencia: morfológicas, letales o deletéreas, condicionales, nutricionales, de pérdida de función, de ganancia de función.

Las consecuencias fenotípicas de las mutaciones son muy variadas, desde grandes cambios hasta pequeñas diferencias tan sutiles que es necesario emplear técnicas muy desarrolladas para su detección.

àMutaciones morfológicas: afectan a la morfología del individuo, a su distribución corporal. Modifican el color o la forma de cualquier órgano de un animal o de una planta. Suelen producir malformaciones. Un ejemplo de una mutación que produce malformaciones en humanos es aquella que determina la neurofibromatosis.

àMutaciones letales y deletéreas: son las que afectan la supervivencia de los individuos, ocasionándoles la muerte antes de alcanzar la madurez sexual. Cuando la mutación no produce la muerte, sino una disminución de la capacidad del individuo para sobrevivir y/o reproducirse, se dice que la mutación es deletérea. Este tipo de mutaciones suelen producirse por cambios inesperados en genes que son esenciales o imprescindibles para la supervivencia del individuo. En general las mutaciones letales son recesivas, es decir, se manifiestan solamente en homocigosis o bien, en hemicigosis para aquellos genes ligados al cromosoma X en humanos, por ejemplo.

àMutaciones condicionales

Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son muy útiles para estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En estos mutantes hay que distinguir dos tipos de condiciones:condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son aquellas condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde la viabilidad, o su fenotipo se ve alterado, debido a que el producto afectado por la mutación pierde su actividad biológica.Condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto del gen mutado es aún funcional.

àMutaciones bioquímicas o nutritivas: son los cambios que generan una pérdida o un cambio de alguna función bioquímica como, por ejemplo, la actividad de una determinada enzima. Se detectan ya que el organismo que presenta esta mutación no puede crecer o proliferar en un medio de cultivo por ejemplo, a no ser que se le suministre un compuesto determinado. Los microorganismos constituyen un material de elección para estudiar este tipo de mutaciones ya que las cepas silvestres solo necesitan para crecer un medio compuesto por sales inorgánicas y una fuente de energía como la glucosa. Ese tipo de medio se denomina mínimo y las cepas que crecen en él se dicen prototróficas. Cualquier cepa mutante para un gen que produce una enzima perteneciente a una vía metabólica determinada, requerirá que se suplemente el medio de cultivo mínimo con el producto final de la vía o ruta metabólica que se encuentra alterada. Esa cepa se llama auxotrófica y presenta una mutación bioquímica o nutritiva.

àMutaciones de pérdida de función: las mutaciones suelen determinar que la función del gen en cuestión no se pueda llevar a cabo correctamente, por lo que desaparece alguna función del organismo que la presenta. Este tipo de mutaciones, las que suelen ser recesivas, se denominan mutaciones de pérdida de función.

àMutaciones de ganancia de función: cuando ocurre un cambio en el ADN, lo más normal es que corrompa algún proceso normal del ser vivo. Sin embargo, existen raras ocasiones donde una mutación puede producir una nueva función al gen, generando un fenotipo nuevo. Si ese gen mantiene la función original, o si se trata de un gen duplicado, puede dar lugar a un primer paso en la evolución. Un caso es la resistencia a antibióticos desarrollada por algunas bacterias (por eso no es recomendable hacer un uso abusivo de algunos antibióticos ya que finalmente el organismo patógeno irá evolucionando y el antibiótico no le hará ningún efecto).

v  15º TEORICO: MUTACIONES EN LOS CROMOSOMAS

Numéricas: poliploidias, aneuploidia. Autoploliploide y alopoliploide. Esterilidad en alopoliploides, corrección de la esterilidad en los alopoliploides.  

àEuploidía: organismos que presentan múltiplos de la dotación cromosómica básica. Por ejemplo, el ser humano tiene 46 cromosomas que es un múltiplo de su dotación cromosómica básica de x=23 (que coincide con el número haploide). Decimos que 46 es el número euploide normal.

àEuploidía aberrante: son aquellos que presentan un número mayor o menor al normal. En el ser humano un aberrante tendría 69 cromosomas que es un múltiplo mayor del normal (nx3).

·         Poliploides: presentan más de dos juegos de cromosomas. Triplodes (3n), tetraploides (4n), pentaploides (5n) y así sucesivamente. A menudo los poliploides tienen un tamaño mayor, en su totalidad y en sus partes, que los euploides normales.

o    Autopoliploides: múltiples dotaciones cromosómicas que se originaron a partir de una especie.

o    Alopoliploides: las dotaciones cromosómicas provienen de dos o más especies. Karpachenko pudo generar una nueva especie a partir del cruzamiento del rábano con la col. Ambos tienen numero diploide 2n=18. Cada uno genera gametos n=9 interfértiles. Se genera un híbrido n₁+n₂=9+9, 2n=18. Pero eran estériles debido a que cada cromosoma no emparejaba en la meiosis. Una duplicación espontanea genero individuos 2n₁+2n₂=18+18, 4n=36. A estos híbridos duplicados se los denomina anfidiploides. Estos sí son fértiles, sus cromosomas sí pueden emparejar. Cuando se cruzaron los anfidiploides con sus parentales (col o rábano) el individuo resultante fue 2n₁+n₂=18+9=27. Ningún caso es fértil. Entonces si consideramos el anfidiplode y consideramos que es fértil con otros de su tipo y en cambio no produce descendencia con sus parentales podemos concluir que se llevó a cabo un proceso de especiación.

·         Monoploide: un individuo diploide que presenta una sola dotación de cromosomas (n). Inicialmente pudo ser diploide y perder un complemento. No se debe confundir con un individuo haploide (n).

àAneuploidia: es una aberración cromosómica donde el número de cromosomas es anormal. El número de cromosomas difiere del tipo salvaje en parte de su dotación cromosómica. Puede tener cromosomas de más o de menos.

Consecuencias de las poliploidias.

àConsecuencias: ganancia en tamaño, especiación, esterilidad.

Ejemplos de poliploidias naturales en plantas y animales.

àPlantas:(evento de especiación más común)

·         Trigo

·         Genero Brassica

àAnimales (son susceptibles y letales salvo excepciones)

Manejo de las poliploidias en el mejoramiento animal y vegetal.

àPlantas:

·         Banana: autotriplode estéril. El fruto no produce semillas.

·         Uvas: autotetraploide. Fruto sin semillas.

·         Algodón: alopoliploide

·         Trigo: alopoliploide

àAnimales:

·         Insectos: Drosophila

·         Crustaceos: Artemia salina

·         Anfibios y reptiles: salamandras, lagartos, sapos y ranas.

·         Peces: salmones y truchas

·         Bivalvos: ostra

Aneuploidía: monosómico, trisómico, nulisómico. Ejemplos de cada uno.

àAneuploidia: (considero para organismos diploides)

·         Monosómico: implica que todos los cromosomas tienen su par homólogo salvo uno que perdió a su acompañante. La nomenclatura es 2n-1.

o    Ejemplos: en los organismos diploides los monosómicos autosómicos son letales. En los cromosomas sexuales monosómicos (XO) produce el síndrome de Turner caracterizado por ser mujeres no fértiles.

·         Trisómico: implica que todos los cromosomas tienen su par homólogo salvo uno que presenta un acompañante extra. La nomenclatura es 2n+1.

o    Ejemplos: en general son letales. Los casos viables pueden ser fértiles. El síndrome de Klinefelter es un caso de trisomía en el par sexual, XXY. Se produce un hombre estéril. El síndrome de Down es una trisomía causada por una no disyunción del cromosoma 21. También puede ocurrir por translocaciones heredables (explicado más adelante). El síndrome de Patau es una trisomía en el cromosoma 13 y el de Edwards en el 18. Estos dos síndromes sobreviven solo unas pocas semanas luego del nacimiento.

·         Nulisómico: implica que todos los cromosomas tienen su par homólogo y se pierde una pareja. La nomenclatura es 2n-2. Se debe aclarar que ese -2 representa la pérdida de una pareja y no la pérdida de dos acompañantes.

·         Cromosomas sexuales: la notación simplemente enumera las copias de cada cromosoma sexual. XXX, XXY, XYY, XO (el O establece ausencia). El razonamiento es el mismo ya que el par sexual forma parte de la dotación cromosómica. Bajo este presupuesto XXX es una hembra trisómica.

àNo disyunción: evento por el cual los cromosomas no se segregan correctamente durante la mitosis o meiosis generando aneuplodía. En la meiosis es más frecuente y el efecto de la no disyunción se observa en todo el organismo. En la mitosis el efecto se observará a manera de mosaicos o parches. A su vez en la meiosis la no disyunción ocurre con mayor frecuencia en la anafase I. Se piensa que el entrecruzamiento es esencial en la correcta distribución de los homólogos.

Concepto de la importancia del balance entre los productos génicos.

àSi consideramos un organismo cualquiera normal observaremos que siempre se cumple una proporción 1:1 entre dos genes cualquiera. Por ejemplo consideremos un diploide, el gen A esta ubicado en el cromosoma 2 y el gen B está ubicado en el cromosoma 3. La proporción de estos genes será, 2A:2B (1:1). Esto se denomina equilibrio génico. Ahora consideremos una trisomia en el cromosoma 3. La nueva proporción será, 2A:3B. Lo mismo podemos hacer para el resto de los cromosomas. El efecto de la dosis génica establece que mientras más cromosomas más transcripto (y proteína) y mientras menos cromosomas menos transcripto (y proteína). Uniendo los dos conceptos podemos decir que la fisiología normal de una célula depende de la proporción correcta de productos génicos en la célula euploide.

Estructurales: deficiencias, duplicaciones, inversiones, traslocaciones recíprocas. Causas de su origen, consecuencias de las mutaciones cromosómicas.

àAlteraciones estructurales:

·         Desequilibradas: cambian la dosis génica de un cromosoma. Causan desequilibrio génico.

o    Deleción: pérdida de un segmento dentro de un brazo cromosómico y yuxtaposición de los segmentos que se encuentran a ambos lados del eliminado.

§  Intragénica: se produce dentro de un gen. Causa su inactividad.

§  Multigénicas: se pierden muchos genes. Resultan letales en homocigosis. En heterocigosis si se pierde mucho material puede ser letal por el desequilibrio génico o bien por la expresión de los genes letales del homólogo.

o    Duplicación: repetición de un segmento en un brazo cromosómico.

§  Tandem: duplicación de dos segmentos adyacentes.

§  Insercional: la copia extra puede estar en cualquier otra parte del genoma.

·         Equilibradas: cambian el orden génico pero no eliminan ni duplican ningún segmento de DNA. Por lo tanto no causan desequilibrio génico.

o    Inversión: un segmento interno se rompe en sus extremos, rota 180° y se vuelve a unir.

§  Paracéntrica: el centrómero se encuentra fuera de la inversión.

§  Pericéntrica: el centrómero se encuentra dentro de la inversión.

o    Translocación recíproca: dos cromosomas no homólogos se rompen formando fragmentos acéntricos que se intercambian recíprocamente.

§  Adyacente 1

§  Alternada 1

§  Adyacente 2

§  Alternada 2

Mutaciones cromosómicas, su identificación durante la meiosis I, gametas que generan.

àDeleción: se identifica por la formación de un bucle de deleción durante el emparejamiento en la meiosis. También por la aparición de pseudodominancia.

àDuplicación: en una duplicación tendremos tres copias de una misma región. En un par homólogo uno de ellos portara una y el otro dos de esas copias. Bajo este presupuesto en el emparejamiento meiótico se formará un bucle en la zona extra.

àInversiones: un heterocigoto para la inversión es un par homólogo que presenta un miembro normal y el otro con una inversión. En el emparejamiento en la meiosis se forma un bucle de inversión.

o    Paracéntrica: se forma un puente dicéntrico y un fragmento ácentrico (se pierde por no tener centrómero). Los productos meióticos (gametos) van a ser muy variados. Uno normal, uno con inversión y dos con deleción (que ocurre por ruptura al azar y no son viables).

o    Pericéntrica: el entrecruzamiento produce cromatides con duplicación, deleción no viables y normales o de otro tipo viables.

àTranslocación recíproca: debido al intercambio de fragmentos se observan emparejamientos característicos como apareamientos en forma de cruz.

Síndrome de Down por Translocación Robertsoniana, gametas que segrega un portador de una traslocación robertsoniana.

àTranslocación Robertsoniana: este tipo de alteración cromosómica genera síndrome de Down por una vía diferente de la no disyunción y trisomía del par 21.

1.       Ocurre una translocación entre el cromosoma 21 y 14. Se pierde el cromosoma translocado del par 21. Los tres restantes son: un 21 normal, un14 normal y un 14 translocado.

2.       Durante el emparejamiento de la meiosis el par 14 empareja por sus fragmentos comunes. El 21, si bien ahora no tiene pareja, puede emparejar con el fragmento del 14 translocado.

3.       Los productos meióticos o gametos serán:

a.        Cromosoma 21 y 14 translocado (genera síndrome de Down). La unión con el gameto normal no genera una trisomía pero habrá un fragmento repetido 3 veces (los propios de cada 21 más el q aporta el 14). Sería una especie de “trisomia” para ese fragmento.

b.       Cromosoma 14 translocado (genera un portador de la tranlocación).

c.        Cromosoma 21 y cromosoma 14 (normal).

d.       Cromosoma 14 (letal). El cigoto no tiene pareja en el 21.

v  16º TEORICO: ELEMENTOS MÓVILES.

Retrotransposones y transposones.

àElementos transponibles: son elementos que se encuentran en el genoma y que tienen la particularidad de no estar fijos en un locus sino que pueden desplazarse o saltar de un sitio del DNA a otro. Las consecuencias de su inserción en un gen pueden ser su inactivación de tipo temporal lo cual genera fenotipos inestables. Además pueden causar roturas en los cromosomas.

Tipos:

Ø  En procariota:

·         IS (insertion sequence) en bacterias.

·         Transposon: se los encuentra en bacterias, son elementos genéticos móviles que confieren resistencia a fármacos. Pueden “saltar” de un plásmido al cromosoma circular y viceversa. En la conjugación el plásmido portador de transposones puede transferirse a otra bacteria.

§  Compuesto: contiene genes situados entre dos elementos IS casi idénticos y orientados en dirección opuesta (repetición invertida, IR). Los IS codifican la proteína transposasa que cataliza el movimiento del transposon. Ejemplos: Tn10 (resistencia a tetraciclina).

§  Simple: también están flanqueados por IR pero de tamaño pequeño y que no codifican transposasa. En lugar de ellos contienen en su región interna el gen para la enzima. Ejemplo: Tn3 (resistencia a ampicilina).

Ø  En eucariota:

·         Retrotransposones (elemento transponible clase 1): se identificaron por primera vez en estudios con levaduras. No se parecen en absolutos a los elementos tranponibles IS ni a los transposones. Se asemejan a retrovirus (virus animales de RNA que emplea la enzima transcriptasa inversa para generar DNA a partir de RNA. La doble cadena de DNA se inserte en el cromosoma hospedador. En esta instancia se denomina provirus. Empleando la maquinaria metabólica de su hospedador genera nuevos RNA viral y con ellos nuevos retrovirus).

·         Transposones de DNA (elemento transponible clase 2)

§  Ac (activator) y Ds (dissociation) en el maíz.

§  Elementos P en Drosophila.

Mecanismo de transposición de ambos.

àMecanismos de transposición:

Transposon

·         Replicativo: el transposon no se inserta sino que replica en el sitio de inserción. Un plásmido donante pasa el elemento transponible a partir de la formación de un cointegrado con el plásmido receptor. La transposasa abre paso entre los dos plásmidos para que se forme el cointegrado. Luego hay una síntesis de DNA y finalmente se resuelven en dos plásmidos, cada uno con el transposon.

·         No replicativo (conservador): el transposon no replica en el sitio sino que es él mismo el que se inserta. Es por ello que a esta ruta se la denomina “cortar y pegar”. El movimiento esta mediado por una proteína transposasa. Esta enzima actúa como una endonucleasa y corta el DNA diana generando extremos escalonados. El elemento tranponible se inserta. El hospedador repara los huecos que al ser escalonados generan en los flancos del transposon dos secuencias idénticas denominadas duplicaciones del sitio de inserción.

Retrotransposon

·         El mecanismo por el cual pueden saltar de una secuencia de DNA a otra es muy similar a la que efectúan los retrovirus en su reproducción. Un retrotransposon inserto presenta genes gag y env (presentes también en el provirus) que codifican enzimas de maduración de RNA y la transcriptasa inversa. Cuando la célula transcribe el DNA también lo hacen las regiones con los retrotransposones. Mediante la transcriptasa inversa el RNA pasa a DNA que está en condiciones de formar un nuevo retrotransposon en otra región del DNA.

Elementos móviles autónomos y no autónomos.

àElemento móvil:

Ø  Autónomo: son elementos transponibles que no requieren a ningún otro elemento para su movilidad (ej. Ac que actúa sobre el gen de pigmentación en el maiz).

Ø  No autónomo: son elementos transponibles en los que su permanencia o escisión está regulada por un segundo elemento (ej. Ds que actúa sobre el gen de pigmentación en el maíz está regulado por Ac).

Sitios preferidos de inserción. Efectos de la transposición sobre el genoma.

àRefugios seguros: debido a que un elemento transponible puede dañar a su hospedador al insertarse dentro de un gen fundamental la presión de selección llevó a que se inserten en zonas no perjudiciales o refugios dentro del DNA.

·         Dentro de otros elementos transponibles.

·         Heterocromatina constitutiva de centrómeros.

·         Inserciones dirigidas: en levaduras la cantidad de material codificante (exones) es muy elevada respecto a la no codificante. Un elemento transponible tendría pocos refugios seguros en este panorama. Codifican proteínas de integración que interactúan con proteínas del DNA para integrarse en sitios específicos. El retrotransposon Ty se inserta en una región del promotor de tRNA. Este mecanismo se denomina direccionamiento.

Utilidad de los elementos móviles en el análisis genético. Ejemplo: elementos P en Drosophila-trangénesis.

àElementos P: se los descubrió en cruzamientos de moscas del género Drosophila. Se emplearon moscas hembra de laboratorio y moscas macho silvestres. La descendencia demostró una amplia variabilidad en sus fenotipos y disgenesis híbrida (moscas biológicamente deficientes). El cruzamiento recíproco provocaba descendencia normal. Lo que ocurría era que los machos silvestres portaban en su DNA elementos móviles denominados elementos P que no se propagaban porque presentaban en su citoplasma represores. Cuando se realizaba el cruzamiento los elementos P podían “reproducirse” sin límite. El citoplasma de la hembra no presenta represores y el espermatozoides no aporta su propio citoplasma (por ende tampoco sus represores). Un elemento P se parece mucho a un transposon de bacterias. Presenta el gen para la transposasa (pero con intrones y exones) flanqueado por repeticiones invertidas. Traducen su propio represor. Cuando los elementos P se reproducen se insertan en genes y producen el bloqueo de su expresión generando individuos disgénicos.

àUtilidad:

·         Marcaje de genes para su clonación: se emplean los elementos P para generar mutantes. Se seleccionan las mutaciones deseadas. Estas tienen el elemento P inserto en el gen mutado, por ende sirve de marca para su cartografía y clonado.

·         Inserción de transgenes: los elementos P pueden emplearse como vectores que permiten introducir genes foráneos dentro de un cromosoma.

Elementos móviles en humanos: LINE, SINE y transposones. Proporción de DNA correspondiente a estos elementos en el genoma humano

àLINE: elementos intercalados largos. Presentan transposición autónoma. Su estructura codifica transcriptasa inversa y no presenta los LTR (repeticiones terminales largas).

àSINE: elementos intercalados cortos. Presentan transposición no autónoma. Su estructura no codifica transcriptasa inversa (dependen de LINE). No presentan LTR. El SINE más estudiado se denomina Alu debido a que su diana de inserción es el gen de la enzima de restricción Alu.

àTransposones de DNA: las mutaciones causadas por ellos son de muy baja frecuencia, suponen menos del 0,2%. Aun así esto no implica que se encuentren en zonas de no codificación.

v  17º TEORICO: REGULACION GENICA

Regulación de la transcripción.

àLos organismos deben regular la transcripción de sus genes para que estos se activen únicamente cuando son necesarios. Si esto no ocurriese se derrocharía mucha energía. Las células (o microorganismos) deben censar permanentemente sus condiciones ambientales para tomar decisiones acerca de cuáles genes deben activarse o desactivarse para traducir las proteínas necesarias. Desde este punto de vista podemos considerar la regulación de la transcripción como una serie de interruptores que se conectan o desconectan en base a las condiciones circundantes.

à El apagado o encendido del interruptor se lleva a cabo por proteínas que interactúan con el DNA. La RNA pol se une a una región denominada promotor para iniciar la transcripción. Las proteínas activadoras o represoras se unen a sitios cercanos al promotor para controlar la accesibilidad de la RNA pol.

Regulación en procariotas: Operón lacZ, regulación positiva y negativa. Estructura del operón lacZ, concepto de policistron, concepto de alosterismo.

àOperón: es una región de DNA que codifica un RNA multigénico (genes estructurales) y que presenta una región reguladora formada por un operador, promotor y sitio de activación.

àOperón lac: encargado de la regulación del metabolismo de lactosa en E. coli.

El operón lactosa presenta los siguientes elementos:

·         Genes estructurales:

·         Gen lac z: codifica la enzima β-galactosidasa, que cataliza la reacción de hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa.

·         Gen lac y: codifica la proteína galactósido permeasa, cuya función es facilitar el transporte de la lactosa al interior de la bacteria colocándose en la membrana plasmática y formando un carrier.

·         Gen lac a: codifica la enzima tiogalactósido transferasa, que cataliza la transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor tiogalactósido. Este gen no está relacionado con el metabolismo de la lactosa.

·         Promotor: región del DNA, precedente a los genes estructurales, que reconoce la RNA polimerasa para llevar a cabo la transcripción.

·         Operador: región del DNA localizada entre el promotor y el comienzo de los genes estructurales, que es reconocida por la proteína represora Lac I.

·         Gen represor (lac I): codifica la proteína represora Lac I, que reconoce la región operadora, donde se une. Impide la transcripción de los genes bajo el control de este promotor pero estimula la unión de la RNA polimerasa formando lo que se conoce como Complejos Cerrados. Cuando el represor se retire (en presencia de inductor que en este caso será lactosa o IPTG), la RNA polimerasa estará lista para formar Complejos Abiertos y empezar la transcripción.

àRegulación:

El operón lac se encuentra bajo un tipo de regulación negativa, donde los genes pueden transcribirse siempre, salvo cuando la proteína represora Lac I se encuentra unida a la región operadora, por la cual presenta una elevada afinidad. En este caso, el promotor del genlac I es constitutivo, por lo que la proteína Lac I se expresa permanentemente y permanece unida en forma de tetrámero a la zona operadora, impidiendo la transcripción de los genes estructurales. La regulación del operón funcionaría de la siguiente forma:

·         En presencia de lactosa: la lactosa es el inductor del operón. Es capaz de unirse a la proteína represora Lac I y generar un cambio conformacional que disminuye su afinidad por la región operadora. De esta forma, la región operadora queda libre, la RNA polimerasa puede transcribir libremente los genes estructurales y la β-galactosidasa puede degradar la lactosa a glucosa más galactosa.

·         En ausencia de lactosa: en ausencia de inductor, la proteína represora Lac I mantiene su elevada afinidad por la región operadora, impidiendo que la RNA polimerasa transcriba los genes estructurales. De esta forma, el sistema permanece cerrado con el consecuente ahorro energético para la bacteria.

Regulacion catabólica:La transcripción de los genes estructurales no dependía únicamente de la ausencia del represor Lac I en la región operadora, sino que además era necesario que se uniera la proteína CRP más AMPc alrededor de la región -60, respecto del comienzo del gen lac Z. La proteína CRP se encuentra en forma de dímero y solo es activa cuando lleva unido AMPc. El alto contenido de AMPc es debido a que en ausencia de transporte de glucosa al interior celular se aumenta la actividad de la adelinato ciclasa (enzima encargada de la síntesis de AMPc). Aquellos mutantes para la adenilato ciclasa (que no producen AMPc) o para la proteína CRP presentaban niveles muy bajos de expresión de los genes del operón lac. Por lo tanto, sin CRP o sin AMPc el sistema permanecería cerrado. Esto unido al hecho de que la glucosa disminuía los niveles de AMPc daba la explicación por la cual la glucosa ejercía una represión por catabolito. 

Control positivo del operón lac: anteriormente se detalló la manera en la que se lleva a cabo una regulación negativa de la transcripción con la presencia de lactosa (si está presente transcribo, si no está presente no transcribo). Por otra parte si una bacteria tiene a su disposición glucosa y lactosa en el medio le resultará más provechoso consumir en monosacárido directamente antes de incluir el disacárido para luego escindirlo (gasto energético adicional).Glucosa y lactosa se consumen al mismo tiempo pero a distinta velocidad. La regulación del operador lac para que disminuya su función cuando hay glucosa es llevada a cabo por un control positivo.

La proteína activadora se denomina CAP. El inductor o efector alosterico es un catabolito, cAMP. Cuando hay mucha glucosa en el medio hay poco cAMP. Por lo tanto CAP se encuentra solo y no puede unirse al operon. Cuando hay poca glucosa en el medio hay mucho cAMP. Este se une a CAP el cual a su vez puede unirse y promover el operón. Lo que realmente hace es aumentar la afinidad del promotor por la RNA pol. Esto abre una serie de posibilidades.

1.       Medio con Glu y sin Lac àà operón no transcribe

2.       Medio con Glu y con Lac àà operón con poca transcripción

3.       Medio sin Glu y con Lac àà operón con mucha transcripción

àPolicistrón: el operón lacz presenta una región con genes estructurales que codifican un mRNA multigénico. Es decir que los genes se traducen como una unidad lo cual es propicio para su regulación conjunta. Este grupo de genes se lo denomina policistrón.

àAlosterismo: las proteínas activadoras y represoras presentan alosterismo. En su estructura presentan un sitio de unión al DNA y un sitio alostérico. A este último se une un efector alostérico (inductor, en este caso lactosa) que genera un cambio en su conformación tridimensional que modifica su sitio de unión al DNA.

Regulación en eucariotas. Principales diferencias con procariotas. Promotor eucariota, regiones reguladoras proximales y distales.

àRegulación: para regular la transcripción de un gen específico hay distintas zonas de unión a proteínas reguladoras. Una de ellas es el conocido promotor al cual se une el complejo proteico con la RNA pol II. Precediendo al promotor se encuentran los elementos proximales. A ellos se unen factores de transcripción generales (GTF). Por último hay zonas denominadas intensificadoras (enhancers o UAS) donde se unen factores de transcripción específicos.

Un factor de transcripción presenta múltiples dominios que cumplen funciones variadas como unión a la cadena de DNA, sensores de las condiciones fisiológicas, interacción con otros TF, interacción con cromatina e interacción con la maquinaria replicativa.

Otra forma de regular la transcripción es modificando la estructura de la cromatina. Mientras más condensada se encuentre será más difícil el acceso de la RNA pol y de los TF. A medida que se descondensa se facilita el acceso. El cambio de posición del nucleosoma permite exponer regiones codificadoras. También se pueden ubicar en zonas expuestas para reprimirlas. Estos mecanismos se denominan remodelación de la cromatina.

àPrincipales diferencias con procariotas:

·         En eucariotas el acceso a la región promotora está restringido por cromatina. Empaquetamiento en nucleosomas.

·         En eucariotas complejos proteicos restringen acceso a la región promotora.

·         Estado basal de los genes, en procariotas es activo, en eucariotas inactivo.

·         En procariotas hay una sola RNA pol, en eucariotas hay tres tipos. A su vez la RNA pol de eucariotas es de mayor tamaño.

·         En eucariotas hay modificación postraduccional.

·         En procariotas la activación de la RNA pol es mediante interacción directa con los activadores. En eucariota la activación es indirecta.

Efecto de mutaciones en regiones reguladoras o en el promotor.

àPromotor: no se acopla RNA pol.

àReguladoras (enhancers):

·         Intensificador: RNA pol transcribe descontroladamente

·         Atenuador: RNA pol transcribe menos de lo normal.

àElementos proximales del promotor: no se transcribe.

Regulación de la estructura de la cromatina: compensación de dosis, sellado (imprinting o impronta génica) de genes, efecto de posición.

àRegulación de la estructura de la cromatina:

·         La acetilación y la desacetilación de histonas induce o reprime la transcripción génica respectivamente

·         Los enhanceosomas son complejos multiproteicos que se unen a las secuencias intensificadoras del DNA. Modifican la transcripción de genes que pueden estar ubicados a grandes distancias. A las unidades del complejo (intensificadores) pueden unirse TF que provocan nuevos reclutamientos o cambios en la cromatina.

·         El complejo SWI-SNF mueve los nucleosomas luego de que son acetiladas las histonas. El SWI-SNF es reclutado por el enhanceosoma.

Heterocromatina facultativa y constitutiva. Modificaciones de las histonas que afectan la transcripción, modificaciones del DNA que afectan la transcripción.Metilacion del ADN, Acetliacion de las histonas à varian el grado de expresión de un gen, incluso llegando a silenciarlo

La heterocromatina se puede dividir en:

·         constitutiva idéntica para todas las células del organismo. Incluye los telómeros y centrómeros. Contiene H3 y H4sub-acetiladas y la H3 metilada en la lisina 9 (H3K9)

·         facultativa diferente en los distintos tipos celulares. Contiene aquellos genes que no se expresan pero que pueden expresarse en algún momento.

Epigenética, como afecta la herencia el sellado de genes o impronta génica.

v  18º TRANSGENESIS

Organismos trangénicos concepto.

àUn organismo transgénico se caracteriza por que tiene insertado en su genoma un fragmento de DNA foráneo o DNA alterado. El gen transferido se lo denomina transgen. El resultado es una alteración en el genotipo y fenotipo del individuo.

Incorporación de DNA en bacterias: formas en que la bacteria incorpora DNA.

àTransformación: incorporación de DNA libre en el medio externo. Ingresa por la pared celular y membrana plasmática por medio de un complejo de unión de DNA y enzimas de degradación de nucleótidos.

Las células se bañan en una solución que contiene la molécula de DNA recombinante la cual entra a la célula y pasa a comportarse como un plásmido.

àTransducción: incorporación de DNA por parte de un virus. La transducción generalizada ocurre en el ciclo lítico cuando por accidente se empaquetan dentro de la cápside fragmentos del cromosoma bacteriano. La transducción especializada ocurre en el ciclo lisogénico cuando el profago inserto en el DNA bacteriano se escinde erróneamente y se lleva consigo pedazos de la cadena bacteriana. Luego entra al ciclo lítico.

El DNA recombinante se incorpora dentro de la cápside. Luego cuando lavirus ataca a otra bacteria introduce el gen foráneo al genotipo del nuevo hospedador.

àEn otro proceso denominado infección el virus con su DNA recombinante termina lisando a la bacteria y produciendo nueva descendencia portadora del DNA recombinante. En este caso la bacteria es un mero intermediario.

Técnicas de transgénesis en plantas y animales. Ejemplos.

àTransformación

àInyección

àInfección bacteriana o viral

àBombardeo con partículas de tungsteno u oro recubiertas de DNA. (gene-gun)

àIngeniería genética en plantas:

·         Plásmido Ti: es un plásmido natural derivado de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens. Cuando ocurre la infección bacteriana de la planta una parte del plásmido se inserta en el DNA del huésped. El fragmento incorporado se denomina T-DNA. Con el viaja una secuencia que comienza a sintetizar opinas en la planta para propio beneficio de la bacteria. Laforma de inserción natural de estos plásmidos lo hace ideal para la producción de plantas transgénicas. Como el plasmido Ti no resulta apto para insertar el gen foráneo se tiene que formar un cointegrado con un vector más pequeño que Ti.

àIngeniería genética en animales:

·         Caenorhabditis elegans: el DNA transgénico se introduce mediante inyección directa como plásmidos, cósmidos u otro tipo de DNA clonado en bacterias. Esto se encuentra facilitado por la naturaleza sincitial de las gónadas. Tiene como dificultad la formación de grupos extracromosómicos de múltiple copia. Es decir que el DNA foráneo no se integra.

·         Drosophila melanogaster: es más compleja que la anterior pero no genera grupos de múltiple copia. Se emplea un elemento transponible P. Hay dos tipos de elemento P. Uno de ellos es autónomo y codifica su propia trasposasa. El segundo es no autónomo y depende del primero. Además presenta secuencias de unión de la trasposasa. Se inyectan al huésped dos plasmidos, uno ayudante y el otro portador del gen. El ayudante codifica transposasa (elemento P autónomo) que cataliza la inserción del segundo elemento P (no autónomo) localizado en el segundo plásmido. El gen se encuentra entre medio del elemento P no autónomo.

·         Mus musculus:

o    Inserción ectópica: inserción del transgen al azar en el genoma. Basicamente consiste en inyectar DNA clonado en bacterias en el núcleo de un óvulo fertilizado. Las desventajas son que la inserción azarosa puede causar mutaciones al interrumpir genes y además el transgen puede ser anulado al no tener las secuencias reguladoras necesarias para su transcripción (efecto de posición).

o    Transgénesis dirigida: inserción del transgen sustituyendo la secuencia homóloga equivalente. Se lleva a cabo una sustitución génica en el sitio normal del gen. Por ende su contexto será el adecuado y no habrá problemas con el efecto de posición. Se lleva a cabo en células madre cultivadas.

§  Noqueado de genes (knockout)

Utilidad de organismos transgénicos.

àTerapia génica humana: se emplea para corregir una condición anormal causada por un alelo mutante mediante la introducción de un alelo transgénico salvaje dentro de la célula.

·         Somática: intenta corregir el fenotipo de una persona tratando solamente algunas células somáticas. Se obtienen células del tejido afectado se las transforma con el gen correcto y vuelven a ser incorporadas al organismo. No es heredable.

·         Germinal: el transgen se incorpora en la línea germinal. Todo el cuerpo es transgénico y el gen foráneo es heredable.

v  19º TEORICO: DNA recombinante

Enzimas de restricción: formas en la que cortan, como se dividen las enzimas de restricción.

àEnzimas de restricción: son enzimas que cortan el DNA en secuencias específicas denominadas dianas de restricción. Genera fragmentos de DNA flanqueados por las dianas de restricción.

1.       Extremos cohesivos: algunas enzimas de restricción cortan el DNA en secuencias palindrómicas y de manera escalonada. Esto genera extremos idénticos que pueden aparearse con otros de la misma naturaleza generando híbridos. Se emplean para generar DNA recombinante.

2.       Extremos truncados.

Vectores en procariotas: plásmidos, virus, cósmidos, BAC.

Plasmidos

àMétodo in vivo:

1.       Se obtiene muestra de DNA con el gen en interés (DNA donante).

2.       Se corta en fragmentos con enzimas de restricción generadora de extremos cohesivos.

3.       Se inserta en un plásmido (cortado previamente con las mismas enzimas). El resultado es un DNA recombinante.

4.       El DNA recombinante se introduceen bacterias.

5.       Crecimiento bacteriano sumado a la replicación autónoma del plásmido amplifican el DNA recombinante (clonación de DNA).

6.       Se emplea una técnica para detectar el gen de interés. Por ejemplo un Southern Blot, reporter.

Virus:

àBacteriófagos:

·         La parte central del gen viral no es esencial para la reproducción. Puede ser cortada con enzimas de restricción y en su lugar implantarse un fragmento de DNA con un gen de interés. Tiene como limitación que el fragmento para incorporar debe ser pequeño (10-15kb).

Cósmidos

Híbridos entre DNA de fago lambda y de plásmido bacteriano. En él se pueden insertar fragmentos de mayor tamaño (>30kb).

BAC

Son cromosomas artificiales bacterianos. Derivan del plásmido F. Pueden contener insertos >150kb.

Vectores eucariotas: YAC, plásmidos.

YAC

Son cromosomas artificiales de levadura. Se forman a partir de un plásmido al cual se le agrega un centrómero, orígenes de replicación y telómeros propios de un cromosoma de levadura. Es decir son una fusión entre plásmido y cromosoma de levadura. Portan insertos de >300kb.

Plásmidos(no pueden replicarse en eucariotas)

YIps: son plásmidos que pueden entrecruzar con cromosomas de levaduras. Esto provoca la sustitución del gen del cromosoma por el del plámido o la integración de todo el plásmido en el cromosoma.

Diferencias y semejanzas de los vectores para procariotas y eucariotas.

·         Las bacterias carecen de la maquinaria para eliminar intrones entonces se deben incorporar cDNA obtenidos a partir de RNA con transcriptasa inversa o DNA sintetizado químicamente. En eucariota puedo insertar DNA genómico, cDNA o sintetizado químicamente.

·         Un vector bacteriano puede contener mucho menos información recombinante que el eucariota.

Vectores de expresión.

Son vectores que contienen promotores bacterianos que inician la transcripción a altos niveles cuando se añade al medio de cultivo el regulador alostérico específico. De esta forma la producción del producto deseado actuaría como un interruptor.

Cómo se obtiene un fragmento de DNA (E de restricc). Cómo se obtiene DNA a partir de RNAm(transcrip inversa). Cómo se hace para clonar un fragmento de DNA o cDNA, cómo se amplifica un fragmento de DNA o un transcrito de una proteína (vectores en cultivo bacteriano, PCR). Cómo se manipula un fragmento de DNA.

·         Un fragmento de DNA se obtiene a partir del empleo de enzimas de restricción que actúan cortando todo el DNA en fragmentos en sitios denominados dianas de restricción.

·         Cuando se emplea transcriptasa inversa se puede obtener cDNA (complementario) a partir de mRNA.

·         La amplificación y clonación se produce por la introducción de DNA recombinante en vectores que se reproducen y replican masivamente como virus y bacterias. Luego se lisa la descendencia y mediante alguna técnica se separa el DNA recombinante del propio de cada organismo (por ejemplo centrifugación).

PCR: descripción, utilidad.

àPCR:

·         Se coloca en tubo de ensayo el DNA con el gen o fragmento de interés, los 4 desoxinucleótidos trifosfato, primers que flanquean el fragmento de interés y una DNA pol especial denominada Taq pol (resistente a altas temperaturas)

·         El primer paso es desnaturalizar la doble cadena. Esto ocurre a temperatura de ~95°C.

·         Luego se incorporan los primers a una temperatura de ~40°C.

·         La taq pol polimeriza la doble cadena. Su máxima acción ocurre a ~80°C.

·         Se repite todo el ciclo varias veces amplificando la diana de DNA.

Electroforesis en el manejo de DNA: utilidad. Transferencia de DNA, RNA o proteínas a celulosa: Southern, Northern, Western.

o    Southern Blot: sirve para detectar un fragmento de DNA concreto. El DNA cromosómico (con el gen de interés) es cortado mediante enzimas de restricción. Se generan fragmentos de tamaños específicos. La separación se lleva a cabo mediante electroforesis. Los fragmentos se mueven a velocidades inversamente proporcionales a su tamaño por la acción de un campo eléctrico. Luego de separados se transfieren a una membrana porosa (nitrocelulosa). Se calienta para fijar los fragmentos a la membrana y para separar la doble cadena. La membrana se sumerge en una solución con la sonda. Esta lleva un marcador radioactivo o fluorescente que revelara la ubicación del fragmento deseado por complementariedad de bases.

o    Northern Blot: sirve para detectar un fragmento de RNA concreto. Se extrae el mRNA del tejido. Se fracciona con enzimas de restricción. Separación por electroforesis. Pasaje a membrana. Fijación. Se emplea como sonda cDNA o mRNA marcado.

o    Western Blot: sirve para detectar una proteína concreta. La mezcla de proteínas se separa mediante electroforesis. Se transfiere a una membrana. Se detecta la proteína buscada mediante anticuerpos acoplados a marcador radioactivo o fluorescente.

Sondas: qué son, cómo se utilizan.

àSonda:

·         Acidos nucleicos: son secuencias marcadas que por complementación permiten identificar la cadena de ácidos nucleicos de interés. Pueden tener acoplado GFP o marcadores radioactivos.

o    Sonda de DNA: para complementar el DNA diana debe exponerse a calor para lograr que las cadenas de doble hélice desapareen.

o    Sonda de RNA

·         Proteínas: pueden emplearse anticuerpos marcados que reconozcan antígenos de superficie en proteínas de interés.

Librería de DNA, de EST: qué son, cómo se construyen, tipos de librerías, cómo se busca en una librería.

àGenoteca: para identificar un gen determinado en todo el DNA se deben construir genotecas. Son colecciones de fragmentos genómicos obtenidos a partir de DNA recombinante amplificado y replicado en diferentes vectores. En el proceso de cortado por enzimas de restricción se generan múltiples fragmentos que representan el DNA genómico. Luego se insertan en los vectores apropiados y se amplifican. Las genotecas pueden ser de DNA genómico (todo el genoma, intrones mas exones) o de DNA complementario (únicamente los exones).

àBúsqueda del gen: se lleva a cabo mediante sondas específicas que marcan el gen clonado deseado.

Secuenciación: Principio general de secuenciación, método de Sanger.

àSecuenciación Sanger:

Este método se basa en la propiedad de corte de un nucleótido especial denominado didesoxi debido a la falta de oxígeno en el carbono 2’ y 3’ del azúcar.(ddNTP’s)

1.       La cadena a ser secuenciada se desnaturaliza, solo se necesita una hebra.

2.       Se agregan al medio los 4 nucleótidos normales (desoxinucleótidos, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) y uno de los 4 didesoxi (para esta vuelta elegimos ddATP).

3.       Se añade un primer específico al sitio de inicio del fragmento deseado.

4.       Se añade la DNA pol que comienza a replicar la cadena.

5.       Se generan múltiples fragmentos que corresponden a la inserción azarosa del didesoxi.

6.       Los fragmentos se corren con electroforesis. Su marcaje puede ser en el mismo primer (marcaje de iniciación) o en el didesoxi (marcaje de terminación).

7.       Se producen en el gel múltiples franjas correspondientes a los distintos cortes.

8.       El procedimiento se repite para los otros didesoxi (ddCTP, ddTTP, ddGTP).

9.       Obtendremos cuatro columnas que podremos corresponder con las bases adecuadas.

Secuenciación manual y automática, cómo es cada una.

Diagnosis de enfermedades mediante técnicas de manipulación de DNA, su correspondencia con otros métodos genéticos de diagnosis (cariotipo, bandeo, análisis de pedigree) ejemplos.

·         Amniocentesis: análisis de células obtenidas del líquido amniótico para detectar alelos defectivos en homocigosis.

·         Biopsia de corion: se obtienen células de la placenta con una jeringa larga.

àEn ambas técnicas se pueden emplear tecnología de DNA recombinante para amplificar secuencias y corroborar su estado con secuencias normales.

àPuede aplicarse PCR y diseñar primers que solo acoplen con genes normales y no lo hagan con genes deletéreos o letales.

v  20º GENOMICA

Estrategias de secuenciación; descripción de cada una.

Ambas estrategias inician empleando enzimas de restricción que cortan todo el genoma en múltiples fragmentos. Cada enzima de restricción tiene su diana (o grupo de dianas), esto propicia que se formen fragmentos de todos los tamaños. A su vez se generan extremos adhesivos que sirven para que cada fragmento generado pueda insertarse en un vector (también tratado con las mismas enzimas). Luego el vector se introduce en un microorganismo el cual se divide masivamente generando la replicación paralela del DNA recombinante. El resultado de todos los fragmentos clonados se denomina librería o genoteca.

àEstrategias:

·         Secuenciación aleatoria de genomas completos: primero se secuencia luego se cartografía. Los múltiples fragmentos de la librería o genoteca genómica se secuencian a partir de la elaboración de primers que acoplan en el vector y que guían la replicación del DNA (ver método de Sanger). Los multiples fragmentos secuenciados solapan formando contigs. Las secuencias repetitivas introducen muchos errores (ocurre en eucariotas, en procariotas no hay problema por q el DNA es de copia única). Una vez elaborados los contigs se forman entre ellos andamios. Los huecos son rellenados con secuencias repetitivas a partir de lecturas de extremos apareados.

·         Secuenciación de clones ordenados: primero se cartografía y luego se secuencia. Los clones de la librería se digieren con enzimas de restricción y los fragmentos resultantes se separan en electroforesis. De acuerdo al nivel de concordancia de las bandas teñidas se estima el nivel de solapamiento.  El solapamiento genera contigs que a su vez se unen a otros y así se ordena o cartografía el DNA. El resultado se denomina mapa físico. Una vez concluido el solapamiento de todos los clones se seleccionan aquellos clones que solapan mínimamente y cubren todo el genoma. Estos clones serán los secuenciados.

Bioinformática: en que consiste, que información nos brinda. 

àBioinformática: estudia el contenido informativo de los genomas. Es una herramienta con un alto poder de predicción.

·         La información que contiene el genoma es muy diversa, no solo la correspondiente a la codificación de RNA y proteínas. Hay sitios de unión a proteínas reguladoras, unión a RNA pol, a mRNA, tRNA, spliceosoma. La identificación de todos estos sitios se denomina anotación. El análisis genómica más la anotación nos permite dilucidar el proteoma (listado de todas las proteínas o polipéptidos).

·         Una de los objetivos de la bioinformática es la determinación de los marcos abiertos de lectura, ORF. Son secuencias que codifican una proteína flanqueadas por los codones de inicio y terminación y a la cual se le han retirado los intrones. Un mecanismo de determinación de ORF es a partir de cDNA alineado junto a la regíon de DNA.

·         BLAST: es un procedimiento que nos permite comparar secuencias con una base de datos. De acuerdo a la cantidad de aciertos o desaciertos podemos establecer por ejemplo la configuración tridimensional de una proteína, dominios. También podemos comparar grado de parentesco.

Mapeo de marcadores moleculares: SNP. RFLP, VRTR (SSLP: minisatélite y microsatélite).

Utilidad de los marcadores moleculares, ejemplos.

Genómica funcional: microarreglos, ensayo de dos híbridos en levaduras.

àMicroarreglos: sobre un chip de vidrio se colocan múltiples gotitas que contienen segmentos de DNA (o cDNA) correspondientes a todos los genes del genoma. El chip es luego expuesto a una muestra de RNA marcado (o cDNA) que hibridará con los genes adecuados del microarreglo. De esta manera podemos averiguar cuáles genes se encuentran activos durante una etapa determinada, en un tipo celular o en alguna condición ambiental determinada.

àEnsayo de dos híbridos: detecta las interacciones físicas entre dos proteínas (A y B). Para vislumbrar la interacción se usa el factor de transcripción Gal4 y un reporter, lacZ.  Se emplean dos plásmidos. Uno presenta el dominio de unión al DNA de Gal4 y el gen que codifica la proteína A que se denomina cebo. El otro presenta el dominio de activación de Gal4 y el gen que codifica la proteína B, denominada diana. Ambos plásmidos se introducen en una célula de levadura. Se incluye también el sustrato X-gal como reporter (unido es incoloro, escindido es azul).

Resultados:

·         No hay interacción: esto se observa porque al no unirse las proteínas tampoco lo hacen las subunidades Gal4 y por ende no actúa promoviendo la transcripción. Al no traducirse la β-galactosidasa del gen lacz entonces el X-gal no es escindido y por ende la no hay coloración.

·         Si hay interacción: las proteínas se unen y por ende también las subunidades de Gal4 que promueven la transcripción. Se traduce β-galactosidasa del gen lacz que cataliza la ruptura de X-gal en galactosa e indol. Este último dimerisa dando una coloración azulada.

Concepto de: proteoma, transcriptoma, interactoma.

àProteoma: secuencia y patrones de expresión de todas las proteínas.

àTranscriptoma: secuencia y patrones de expresión de todos los transcritos.

àInteractoma: conjunto completo de interacciones físicas entre proteínas y segmentos de DNA, entre proteínas y segmentos de RNA, y entre proteínas con proteínas.